槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定

1槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定槐米为豆科植物槐（SophorajaponicaL．）的未开放花蕾。味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。槐米常炒炭应用。槐米的主要化学成分为芦丁，其含量可达12～16％，其次含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。芦丁具有Vitp样作用，可降低毛细血管脆性和调节通透性。临床上用作毛细血管脆性引起的出血症，常作为高血压症的辅助治疗药。[目的要求]1．通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。2．掌握槲皮素的制备原理及操作。3．熟悉紫外光谱在黄酮结构鉴定中的应用4．通过芦丁的结构检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。[实验原理]芦丁（rutin）：C27H30O16·3H2O，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。槲皮素（quercetin）：C15H10O7·2H2O，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择+鼠李糖+葡萄糖2重结晶方法进行精制。芦丁可被稀酸水解生成槲皮素及葡萄糖、鼠李糖，依此进行制备槲皮素。通过纸色谱及紫外光谱进行黄酮及糖的鉴定。[实验内容]一、芦丁的提取分离及精制方法⑴槐米粗粉（50g）置1000ml烧杯中，加入500ml饱和石灰水，加热，并维持pH8～9煮沸20分钟，趁热用脱脂棉滤过滤液药渣用300ml饱和石灰水煮沸10分钟，维持pH8～9趁热滤过滤液药渣（×）合并在60℃～70℃下用浓HCl调pH至4～5静置，抽滤沉淀低温（80℃）干燥，称重。按1：200的比例加水，加热使溶解，趁热滤过滤液静置，抽滤，减压干燥，计算收率芦丁精制品3方法⑵利用芦丁在冷热溶剂中的溶解度不同进行提取分离。槐米粗粉沸水煮沸5～10分钟，反复2次趁热滤过水提取液药渣放冷沉淀析出（粗芦丁）热水重结晶或乙醇重结晶芦丁结晶二、槲皮素的制备称取精品芦丁1g置250ml烧瓶中加2%H2SO4200ml加热回流1小时放冷，静置，抽滤酸性滤液沉淀中和水洗两次，干燥乙醇重结晶中性滤液称重，计算收率浓缩黄色细针状结晶浓缩液（槲皮素）（供糖的PC鉴定）4三、检识反应1．芦丁的定性反应取芦丁适量，加乙醇使溶解，分成三份供下述试验用：(1)盐酸镁粉试验：取样品液适量，加2滴浓HCl、再酌加少许镁粉，即产生剧烈的反应，并逐渐出现红色至深红色。(2)锆-枸试验：取样品液适量，然后加2％ZrOCl2的甲醇溶液，注意观察颜色变化，再加入2％枸椽酸的甲醇溶液，并详细记录颜色变化。(3)α-萘酚-浓硫酸反应：取样品液适量，加等体积的l0％α-萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁缓加浓硫酸，注意观察两液界面的颜色。2．芦丁的UV(1)鉴定试剂的配制①甲醇钠溶液：取0.25g金属钠，切碎，小心加入色谱甲醇10ml中，此液置于玻璃瓶中，用橡皮塞密封。②三氯化铝溶液：取1g无水三氯化铝，小心加入色谱甲醇20ml中，放置24小时后全部溶解即得。③醋酸钠：用无水粉末醋酸钠。④⑤硼酸饱和溶液：取无水硼酸，加入适量色谱甲醇、制成饱和溶液。（上述贮备液可放置六个月）（2）芦丁溶液的配制精密称取芦丁纯品0.5g，用甲醇适量溶解至50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。（3）光谱的测定①甲醇光谱：取样品液置石英杯中，至200～500nm内进行扫描，重复一次，观察紫外光谱。②甲醇钠光谱：取样品液置石英杯中，加入甲醇钠溶液3滴后，立即测定，放置5分钟后再测一次。③三氯化铝光谱，在盛有样品液的石英杯中，加入三氯化铝6滴，放置1分钟后进行测定。测定后加入3滴盐酸溶液（盐酸：水＝1：1）再进行测定。④醋酸钠光谱：取样品液约3ml，加入过量的无水醋酸钠固体，摇匀（杯底剩有约2mg的醋酸钠），加入醋酸钠后两分钟内测定，5分钟到10分钟后再测定一次。3．芦丁及槲皮素的色谱5支持剂：中速层析滤液（5×20cm）展开剂：正丁醇-醋酸-水（4：1：5）上层样品：自制槲皮素的乙醇溶液自制芦丁的乙醇溶液对照品：槲皮素标准品的乙醇溶液芦丁标准品的乙醇溶液显色剂：三氯化铝乙醇溶液喷雾4．糖的纸色谱检识支持剂：中速层析滤纸（5×20cm）样品：取水解后的滤液10ml，水浴加热，且在搅拌下加适量碳酸钡细粉至PH中性，过滤，取滤液并浓缩至2mI左右，放冷后，供纸色谱点样用。对照品：1％葡萄糖标准品醇溶液及1％鼠李糖标准品醇溶液展开剂：正丁醇-醋酸-水（4：1：5）上层显色剂：喷以邻苯二甲酸苯胺溶液，105℃烘烤5分钟至斑点显色清晰。[实验说明及注意事项]1．用石灰水调节芦丁提取溶液的PH，既可以达到碱提取芦丁的目的，还可以除去槐米中含有的大量粘液质。但钙离子浓度及pH值均不宜过高，否则多余的钙能与芦丁形成螯合物沉淀，同时黄酮母核在强碱性条件下易被破坏。2．用HCl调PH时，应注意PH不要过低，因为PH过低（PH2以下）会使芦丁形成钅羊盐而使已形成的沉淀重新溶解，同时黄酮母核也会在强碱性条件下被破坏，导致收率下降。3．注意观察槲皮素制备过程中的实验现象。[思考题]1．苷类结构检识的一般程序？2．苷类水解有几种催化方法？3．怎样确定芦丁结构中糖基是否联结在槲皮素3-O位上？4．怎样证明芦丁分子中只含有一个葡萄糖及一个鼠李糖？5．UV在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。