樟科药用植物山鸡椒的化学成分和药理活性研究进展

描述：山鸡椒是樟科木姜子属植物，其根、茎和果实均可入药，具有祛风散寒、理气止痛等功效，在民间应用广泛。该植物主要含有生物碱类，特别是阿朴啡生物碱，也含有少量的黄酮、木脂素及其他类成分。相关药理研究显示，山...[摘要]山鸡椒是樟科木姜子属植物，其根、茎和果实均可入药，具有祛风散寒、理气止痛等功效，在民间应用广泛。该植物主要含有生物碱类，特别是阿朴啡生物碱，也含有少量的黄酮、木脂素及其他类成分。相关药理研究显示，山鸡椒在治疗心血管疾病、抗肿瘤、抗炎、提高免疫力、平喘抗过敏、抗氧化、抗菌、杀虫等多方面都有较好的效果。该文对山鸡椒的化学成分及药理活性进行了全面的归纳，以期对本种药用植物的综合研究和应用提供参考。樟科Lauraceae木姜子属植物山鸡椒Litseacubeba（Lour）Pers.，又名山苍树、山苍子、木姜子、木香子、野胡椒、香粉树、过山香、土澄茄及满山香等，是一种多年生雌雄异株的乔木或灌木，树皮幼时黄绿色、光滑，老时灰褐色。叶互生，有香气，两面无毛。伞形花序，花小，黄白色。果实近球形，幼时绿色，熟时黑色。山鸡椒适应性强，生长迅速，广泛分布于亚洲东部、大洋洲和太平洋诸岛、印度、马来西亚、印尼等。我国山鸡椒资源丰富，主要分布于长江以南，广西、广东、福建、江西、江苏、浙江、湖南、云南、贵州、四川等省[2]。目前，在福建、湖南和四川等地已有人工营造的山鸡椒林。山鸡椒性温，味辛、微苦。果实入药，称“荜澄茄”，可温中散寒，行气止痛，用于胃寒呕逆，脘腹冷痛，寒疝腹痛，寒湿郁滞和小便浑浊。根及根茎入药，称“豆豉姜”，具有祛风除湿，理气止痛之功效，主治感冒、心胃冷痛、腹痛吐泻、脚气、孕妇水肿、风湿痹痛、跌打损伤及脑血栓形成等。山鸡椒鲜果捣烂吞食，可治疗食积气胀、脘腹冷痛、反胃呕吐、肠鸣泄、中暑和支气管哮喘等疾病；鲜果捣烂外敷，可治疗无名肿痛与皮肤病等。另外，山鸡椒的果实还用于食品香料，添加在各种腌渍食品内，风味特殊又能抑制好氧菌的生长。前人对山鸡椒的研究进展有过部分总结，但没有从化学成分和药理活性研究方面进行系统的归纳。本文着重对山鸡椒，包括其根、茎木、树皮和果实等各个药用部位的化学成分与药理活性进行综述，以期对本种植物的药用研究和进一步的开发应用提供借鉴。1化学成分研究迄今为止，山鸡椒植物中已有65个化合物被分离鉴定，结构类型和木姜子属其他植物类似，主要为生物碱，尤其是阿朴啡类生物碱，和少量的黄酮、木脂素、脂肪酸、甾体等（表1，图1）。同时，作为一种樟科芳香性药用植物，山鸡椒富含挥发油，众多学者报道，通过GC-MS鉴定其挥发油成分达75种之多，主要为单萜和倍半萜类。研究表明，山鸡椒根、茎、叶、花、果实各部位挥发油的主要成分有明显差异。1.1生物碱类虽然化学成分之多寡和研究目的与检测手段相关，但从已报道的数据分析，生物碱是本种植物的压倒性优势成分。到目前为止，有36个异喹啉类生物碱（1～36）被分离鉴定。从结构类型上分析，绝大多数是阿朴啡生物碱类，包括部分与高氯酸形成有机盐（表1，图1）。因此阿朴啡生物碱是山鸡椒中名符其实的主要和特征性成分。此类生物碱的活性明显，受到学者的广泛关注。如化合物20，23和24具有抗金黄色葡萄球菌和抗真菌Altemariaalternata与Cercosporanicotianae的活性，25和26对6种肿瘤细胞株表现出显著的细胞毒性。化合物36能够抑制血小板聚集和血栓素B2的形成，表明其抗血栓活性。化合物2和19有抗菌活性，且19显示显著的抗金黄色葡萄球菌活性等。药理活性结果为山鸡椒广泛的传统药用、食品调味及防腐应用等方面提供了科学依据。此外，还从该植物中报道了7个酰胺类生物碱（37～43），包括从根中分离鉴定的N-反式阿魏酰-3-甲氧基酪胺（37）、N-顺式阿魏酰-3-甲氧基酪胺（38）、N-反式香豆酰酪胺（39）、N-反式阿魏酰酪胺（40）、山鸡椒胺甲（41），以及从山鸡椒枝中分离鉴定的酰胺类成分42和43。表1山鸡椒中分离鉴定的化合物（1～65）Table1Chemicalconstituents1-65isolatedfromLitseacubeba续表12.3实时荧光定量PCR冰上配置反应体系为10μL，包含5μLPowerSYBR？GreenPCRMasterMix（AppliedBiosystems，USA），1μLcDNA，1μLprimers（上下游引物已混合，各引物的量约为2.5mmol·L-1），ddH2O3μL，在ABI7500定量分析仪上进行反应。PCR扩增条件为：50℃（2min），95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火和延伸1min，40个循环。最后熔链阶段：95℃，15s；60℃1min；95℃15s。根据本实验室前人使用不同浓度Cd处理黄花蒿后对测得的黄花蒿素含量进行分析，本次实验以镉胁迫1d的黄花蒿叶片为材料，7个处理浓度，每个处理3个生物学重复，共计21个样品（为了减小个体差异对内参基因稳定性差异分析的影响，本实验在分析时使用3个生物学重复中所有样品的Ct），同时每个样品设3个技术重复，并设阴性对照。2.4数据分析qRT-PCR结束后，使用ABI7500定量分析仪自带软件Version2.0.1自动进行数据分析，得到各样品的Ct，用geNorm，NormFinder，BestKeeper，DeltaCT法，同时登陆利用RefFinder对各内参基因的稳定性进行分析。geNorm软件先计算出每个候选内参基因的稳定性值（M），然后计算某一内参与其他内参的配对变异系数（pairwisevariation），即Vn/n+1。通过M对候选内参基因的稳定性进行排序以及Vn/n+1判定所需内参基因的最适数目。NormFinder软件结合组内方差与组间方差，计算出稳定值（stabilityvalue），根据稳定值的大小对内参基因的稳定性进行评价。geNorm软件与NormFinder软件在分析数据的数据时，期刊论文都要将Ct转化成相对定量的数据，然后才可导入到各自的MicrosoftExcel中进行稳定性分析。数据转化的具体方法为：找到最低的Ct（某一内参基因在所有样品中的Ct），即该样品中该基因的表达量最高并设定为1，然后用所有其他样品的Ct减去最低Ct，得到ΔCt，再通过2-ΔCt计算所有其他样品表达量，最后将表达量数据导入MicrosoftExcel中，后面分析方法按照geNorm与NormFinder软件说明书操作。BestKeeper软件根据各组样品候选内参基因的Ct，对样品进行配对相关分析，计算标准偏差（SD），变异系数（CV）及各基因间的配对相关系数（泊松相关系数），根据SD评估内参基因的稳定性。DeltaCT法根据各组样品候选内参基因的Ct，对候选内参基因进行两两配对，计算配对基因在所有样品中的ΔCt、平均ΔCt、标准偏差（SD），然后计算某一内参基因与其他内参配对后的平均标准偏差（meanSD），最后根据平均标准偏差值评估内参基因的稳定性。BestKeeper软件与DeltaCT法共同之处就是都不需要将Ct进行2-ΔCt转化，直接根据Ct进行数据分析。RefFinder则整合上述4种分析方法，并对每个基因单独用4种分析方法评价时的排名求几何平均值，得到一个综合排名指数，该指数越小，说明该内参基因越稳定。3结果3.1内参基因引物特异性及扩增效率的评估以不同浓度镉处理黄花蒿的叶片cDNA为模板，进行qPCR分析。通过ABI7500定量分析仪自带的软件Version2.0.1自动绘制出内参基因PCR产物的熔解曲线，结果显示只有明显的单一信号峰，说明引物特异性好。将样品cDNA按一定倍数进行梯度稀释（5个稀释浓度），以lg[起始DNA]为横坐标，对应的Ct为纵坐标绘制标准曲线，计算标准曲线的斜率k，再根据公式（1+E）=10-1/k计算出扩增效率E。各内参基因特异性引物的参数见表2。表2qRT-PCR分析中5个内参基因特异性引物参数Table2TheparametersderivedfromqRT-PCRanalysisoffivegene-specificprimerpairs3.2内参基因的表达谱分析对21个样品5种内参基因的表达水平（Ct）进行分布分析，结果显示黄花蒿在不同浓度镉处理下，候选内参基因Ct为15.91～26.59。同一样品中相对于其他内参18SrRNA的表达水平最高，Ct为15.91。在所有样品中18SrRNA的Ct变化范围最小，ΔCt为3.78，其次是Actin，ΔCt为4.63，变化范围最大的PAL，ΔCt为5.95，见图1。各样品中内参基因ΔCt的变化从一定程度上说明了内参基因的表达并不是恒定不变的，因此有必要选择合适的内参基因进行定量。3.3不同处理组内参基因的稳定性分析3.3.1geNorm分析利用geNorm程序对各内参基因表达稳定性进行分析，通过计算基因的表达稳定值（M），对基因的表达稳定性进行排序，M越小，表明基因稳定性越高，见图2。结果显示，黄花蒿在不同浓度镉处理下内参基因表达稳定性由高到低依次为18SrRNA/ActinPALGAPDHCPR。由此可见18SrRNA和Actin的表达最为稳定，CPR稳定性最差。用SPSS17.0对所用样品每个内参基因的Ct进行分析，箱分别代表的是第25百分位数和第75百分位数，箱中间的线代表中位数，上下线分别代表最大值和最小值。图1qRT-PCR中5个内参基因的Ct分布Fig.1TheCtvaluedistributionoffivereferencegenesinqRT-PCR图2geNorm分析不同浓度镉处理下5种内参基因的稳定性Fig.2GeneexpressionstabilityandrankingofthefivereferencegenesascalculatedbygeNorminalltestedsamplesunderdifferentconcentrationsofCd3.3.2NormFinder分析利用NormFinder程序分析Actin，18SrRNA，PAL，GAPDH，CPR的基因表达稳定性，其稳定值依次为0.341，0.462，0.505，0.533，1.336，根据稳定值越小则基因表达越稳定的原则，内参基因稳定性由高到低依次为Actin18SrRNAPALGAPDHCPR，与geNorm程序分析结果基本一致，即在不同浓度镉处理下Actin的表达最为稳定，CPR稳定性最差。3.3.3BestKeeper分析利用BestKeeper软件分析候选内参基因表达稳定性，其SD大小顺序依次为18SrRNAGAPDHActinPALCPR，根据使用SD评估内参基因稳定性的原则，SD越小内参越稳定。因此在不同浓度镉处理下18SrRNA的表达最稳定，CPR稳定性最差。对比上述2种分析方法，BestKeeper与geNorm和NormFinder的分析结果存有差异。3.3.4DeltaCT分析采用DeltaCT法分析Actin，18SrRNA，PAL，GAPDH，CPR的基因表达稳定性，通过计算各内参基因的平均标准偏差（MeanStdDev），对基因的表达稳定性进行排序，平均标准偏差越小，表明基因稳定性越高，见表3。结果显示，黄花蒿在不同浓度镉处理下内参基因表达稳定性由高到低依次为Actin18SrRNAPALGAPDHCPR，即在不同浓度镉处理下Actin的表达最为稳定，CPR稳定性最差。分析结果与geNorm和NormFinder的分析结果基本一致，但与BestKeeper分析结果有一定差异。表3内参基因配对比较Table3Pairsofreferencegenescomparison注：平均ΔCt表示配对基因在21个样品中平均差异，标准偏差代表配对基因在21个样品中Ct的变异。3.3.5RefFinder分析RefFinder是基于Web开发的在线分析工具，集合了上述4种计算程序和方法（geNorm，NormFin