正交试验法优选复方三七活血颗粒中药材的提取工艺研究

正交试验法优选复方三七活血颗粒中药材的提取工艺研究张述耀1（汕头大学医学院附属肿瘤医院药剂科，汕头市515041）摘要目的:优选复方三七活血颗粒中药材的最佳提取工艺。方法:采用正交试验法，以提取液中三七总皂苷的含量以及总固体得率为指标，综合评分优选药材的提取工艺。结果:药材较优的提取工艺为加水12倍，提取3次，每次2h。结论:优选的提取工艺各活性部位提取率高，操作简便，适用于生产。关键词：复方三七活血颗粒；正交试验法；提取工艺；三七总皂苷StudyontheExtractionProcessofHerbsinCompoundSanqiHuoxueGranulesbyOrthogonalDesignZHANGShu-yao（pharmaceuticalpreparationsectionofAffiliatedCancerhospitalofMedicalCollegeofShantouUniversity,Shantou,Guangdong515041）AbstractObjective:Thetechnologyofoptimalextractionforcompoundsanqihuoxuegranulesisinvestigatedinthisstudy.Methods:Orthogonaltestwasemployedforselectingtheoptimumofextractiontechnologybycolligationscoreandtheindexesofthecontentsofpanaxnotoginsengsaponins,totalsolidmattersinwaterextraction.Results:Twelvevolumesofwater,extracting3timeswithtwohoursforeachtimewasconsideredtheoptimumextractiontechnologyofherbs.Conclusion:Theconsiderableextractionrateofactivecomponentsinthedrugsisachievedbyapplyingtheselectedtechnology,andthesimplemethodisfitforproduction.Keywords:compoundsanqihuoxuegranules;orthogonaldesign;extractiontechnology;panaxnotoginsengsaponins复方三七活血颗粒由三七、骨碎补、红花、续断等13味药材组方而成，原处方收载于部颁标准三七活血丸中，具有活血、通络、散瘀的功效，临床上广泛用于铁打损伤、骨折初期肿胀严重者的治疗，具有疗效可靠、不良反应少、无须联合用药的优点。本处方药味多，成分复杂，原制剂工艺简单，在剂型方面，以每丸重9g的大蜜丸用药，不仅服药量大，病人耐受性差，而且挥发性成分易损失、质量难以控制。本实验以最大限度地提取药材中的有效成分，避免有效成分的分解流失和无效成分的溶出为原则，根据处方中有效成分的理化性质和药理作用，以三七的有效成分人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量之和（以下简称Ⅰ）及总固体得率为指标，采用正交试验法，进行三七活血颗粒中药材提取工艺的研究，以减小剂量、创新剂型、提高临床疗效、改善病人服药顺应性，并为生产提供依据。1仪器与试药WATERS2695/2996型高效液相色谱仪（美国）；所有药材均购自中山市中智药业有限公司。人参皂苷Rb1（批号:110704-200318)、人参皂苷Rg1（批号:110706-200319)、三七皂苷R1（批号:110736～200321)（均购自中国药品生物制品检定所）。乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。2方法与结果2.1含量测定方法的建立2.1.1色谱条件色谱柱KromasilC18(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm。理论板数按三七皂苷R1峰计算不低于4000。表1流动相的比例Tab.1proportiontomobilephase时间（分钟）流动相A（%）流动相B（%）0～15188215～6018→3582→652.1.2线性关系考察精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg11.112mg、人参皂苷Rb11.214mg、三七皂苷R10.601mg的混合溶液，即得对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色谱仪。按上述色谱条件测定峰面积，以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1进样量微克数为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为人参皂苷Rg1：y=274124.43x-81798.17(r=0.9991)，线性范围：5.56μg～27.8μg；人参皂苷Rb1：y=216225.26x-125245.55(r=0.9993)，线性范围：6.07μg～30.35μg；三七皂苷R1：y=239769.46x-38788.28(r=0.9998)，线性范围：3.005μg～15.025μg。2.1.3供试品溶液的制备按处方量称取药材提取，提取液浓缩定容至2000ml容量瓶中。精密移取提取液5ml，加用水饱和的正下醇溶液10ml振摇15分钟，取上清液，加3倍量以正丁醉饱和的水溶液，摇匀，放置使分层，取正丁醇层，置蒸发皿中，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至5ml，作为供试品溶液。2.1.4空白溶液的制备按处方量称取除三七外的其余药材进行提取，按“2.1.3”项下制备空白供试品溶液。2.1.5含量测定照《中国药典》2005年版一部附录VI项高效液相色谱法测定。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注人液相色谱仪，测定，即得。见图1。ABC图1高效液相色谱图A对照品；B样品；C阴性样品；Fig1HPLCA.Referencesubstance;B.Sample;C.NegativeSample;2.2正交试验设计与结果2.2.1正交试验设计根据方中药物的性质、现代药理学研究结果和中国药典中三七药材的质量控制指标[1][2]，以测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量和总固体得率为指标，用正交试验优选处方中药材的提取工艺条件。根据预试验结果，选取影响提取效果的因素和水平，试验方案见表2：表2实验因素水平表Tab.2Factorsandlevelsofexperiments水平因素加水量提取时间提取次数(倍)A（h）B(次)C1611291.52312232.2.2样品溶液的制备：按处方量称取三七等13味药材，按L9（34）试验列号各条件分别回流提取、滤过，并浓缩定容到2000ml，放置备用。2.2.3总固体得率的测定：精密量取各提取液100ml置已恒重的蒸发皿内，水浴蒸干，置105℃烘箱中，干燥3h，取出置干燥器中冷却0.5h，称重，置105℃烘箱中，干燥1h，至恒重，计算总固体得率。2.2.4含量测定：按“2.1”项下测定供试品溶液中三七总皂苷（I）的含量。2.2.5试验数据见表3，方差分析见表4。表3正交试验结果Tab.3Resultsoforthogonaldesign试验号列号试验结果1234因素总固体I的含综合得分量（g）ABCD得率(%)1111110.480.7442.92122216.540.9059.13133320.771.5888.64212317.461.0464.65223121.731.7495.56231212.791.3767.27313218.161.8893.48321312.621.5773.39332120.311.6289.1Ⅰj63.53366.96761.13375.833Ⅱj75.76775.96770.93373.23391iyi673.7Ⅲj85.26781.63392.50075.500CT=50430.19Rj21.73414.66631.3672.600注：综合评分＝（总固体得率/最大总固体得率）×100×0.4+（Ⅰ的含量/最大Ⅰ的含量）×100×0.6表4方差分析结果Tab.4Resultsofanalysisofvariance方差来源离均差平方和自由度F值F临界值显著性检验A712.242259.30919.000P＜0.05B328.222227.33119.000P＜0.05C1545.0292128.65619.000P＜0.05D12.012-19.000F0.05(2,2)=192.2.6结果分析：由直观分析可知较优的提取工艺是A3B3C3。由方差分析结果可知，加水量、提取次数、提取时间对提取效果有显著差异，比较各因素的极差值可以看出，影响提取效果的因素顺序为C＞A＞B。综合分析结果，选择加水量为12倍量，提取3次，每次2h。所以确定药材较优的提取工艺条件为A3B3C3。2.2.7验证实验：分别按处方量称取药材按较优工艺A3B3C3提取，并测定三七总皂苷的含量和总固体得率。经验证，此工艺能提取出的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量之和约是1.889g，含量达11.2%。说明此提取工艺合理可行、稳定。3讨论3.1三七中所含皂苷类成分为其主要活性成分[3]，包括三七皂苷R1、R2，人参皂苷Rb1、Rd、Rg1等。此类成分溶于甲醇、乙醇和水。本实验是把大蜜丸剂改剂型为颗粒剂，颗粒剂溶于水后，提高生物利用度，所以本实验采用水作为溶剂提取药材，以尽可能地提出水溶性成分，以利于制剂成型的需要。3.2中药提取物的总固体是其发挥疗效的物质基础，所以本实验以其作为考察提取工艺优劣的一个指标。3.3本实验通过系统的研究三七活血颗粒中药材的提取工艺，建立了操作简捷、合理的提取工艺，这为三七活血颗粒提供一种生产周期短、生产成本较低、操作简便、且无需增加企业设备投资的工艺参考。参考文献：[1]张湘杰，何永恒．花椒、延胡索、没药、三七4味中药止痛作用的药理学研究进展[J]．中国中医药现代远程教育，2009，7(3)：96-98。[2]国家药典委员会编．中国药典（一部）［S］．北京：化学工业出版社，2005：10.[3]邓志军，郭洁文，杨敏，潘竞锵，曾英彤．三七总皂苷及其活性单体药代动力学的研究进展[J].今日药学，2009，19(1)：24-27。1通讯作者：张述耀，男，主管药师，主要从事医院药学工作。E-mail:[e-mail]通信地址：汕头大学医学院附属肿瘤医院药剂科,邮编：515041。