比较三种样品处理方法对动物组织DNA提取效果的影响

比较三种样品处理方法对动物组织DNA提取效果的影响摘要：采用三种不同处理方法对各种动物组织样本进行处理，后续提取采用的相同的方法（磁珠法），对每种组织样本用这三种处理方法最终的DNA提取效果进行了比较。结果表明，直接加裂解液研磨处理法提取的DNA产量和纯度都比较高，是最合适的样品处理方法。关键词：样品处理方法；DNA提取；动物组织随着生活水平的不断提高，人们对食品的安全性需求日益迫切。因此，建立快速、准确、高效的DNA检测技术对食品安全检测、标识以及管理等方面至关重要[1]，而DNA的提取效率，尤其是DNA的提取纯度对实验结果的准确性具有重要影响[2]。因此，在检测方法建立之前，研究开发快速、适宜的DNA提取处理方法对保障后续测试实验顺利进行具有重要意义[3]。本实验分别采用了三种不同的样品处理方法对不同的动物组织进行了DNA的提取，探讨出了最合适的处理方法，为后续进行相关的核酸检测技术提供必要的样品处理方案。1材料与方法1.1材料磁珠法动物基因组DNA提取试剂盒（洛阳惠尔纳米科技有限公司）1.2DNA提取方法一：称取30mg组织样品，加入生理盐水200µL，研磨，离心，弃上清液后依次加入250µLBufferA，20µLBufferB，20µLBufferC，65℃裂解15min,加入5µL磁珠（02N200）和300µL异丙醇，结合5min，依次用500µL洗脱液Ⅰ和500µL洗脱液Ⅱ洗脱后，晾干5min，最后用100µLTE洗脱液于55℃下洗脱DNA5min。每个样品测三次，取平均值。方法二：称取30mg组织样品，加入生理盐水200µL，20µLBufferB，研磨，离心，弃上清液后依次加入250µLBufferA，20µLBufferC，65℃裂解15min,加入5µL磁珠（02N200）和300µL异丙醇，结合5min，依次用500µL洗脱液Ⅰ和500µL洗脱液Ⅱ洗脱后，晾干5min，最后用100µLTE洗脱液于55℃下洗脱DNA5min。每个样品测三次，取平均值。方法三：称取30mg组织样品，直接加入250µLBufferA，20µLBufferB，20µLBufferC，研磨后，65℃裂解15min,加入5µL磁珠（02N200）和300µL异丙醇，结合5min，依次用500µL洗脱液Ⅰ和500µL洗脱液Ⅱ洗脱后，晾干5min，最后用100µLTE洗脱液于55℃下洗脱DNA5min。每个样品测三次，取平均值。1.3DNA的纯度检测用美国Quawell超微量紫外分光光度计Q5000对提取结果进行检测。用吸取5µL超纯水清洗载样台三次，吸取2µL待检样品，加到载样台上进行检测。1.4琼脂糖凝胶检测DNA的完整性采用1×TAE溶液配制出1%的琼脂糖凝胶，取10µLDNA溶液、2µL6×LoadingBuffer以及2µL花菁染料混合后，点样，100V恒定电压条件下电泳25min。然后将琼脂糖凝胶块在凝胶成像系统下观察分析，并拍摄电泳图谱。2结果2.1不同处理方法下的DNA纯度与浓度实验中对提取的DNA纯度和浓度进行了测定，实验结果见表1。由于核酸在260nm处有最大吸收值、蛋白质在280nm处有最大吸收值，因此用OD260/OD280值反映蛋白质除去情况，由于230nm处大多是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳水化合物的吸光度，因此OD260/OD230值的大小反映了提取的DNA样品中盐分、碳水化合物以及有机溶剂等的除去情况。表1不同方法提取的DNA纯度、浓度样品OD260/OD280OD260/OD230浓度（ng/µL）方法一方法二方法三方法一方法二方法三方法一方法二方法三牛肉1.641.831.770.731.321.0627.5395.6799.03羊肉1.821.851.901.131.431.63104.90143.37211.07鸡肉1.801.891.871.351.551.3272.57127.17124.70从表1中可以看出，不同动物组织采用3种处理方法提取的DNA的OD260/OD280值和OD260/OD230值有一定的差别。但基本上都在或接近1.7-1.9之间的理想值内。表明蛋白质除去效果较好，提取的DNA纯度较高。但测试的OD260/OD230值都小于2.0，表明所提取的DNA中残存有多糖、盐分以及其它小分子杂质。就提取的DNA浓度来看，方法二和方法三的量要优于方法一。从测试结果整体来看，方法二对不同的动物组织提取的DNA纯度较高，含杂质少，能够满足检测要求。2.2不同提取方法的DNA完整性对不同处理方法提取的动物组织DNA样品的琼脂糖凝胶电泳图谱见图1。整体来看，各个样品的条带明暗程度差异较大，但基本上与各样品DNA的提取浓度的大小趋势保持一致。方法三提取的DNA条带（7-9）最亮，说明产量较高、杂质含量较少。泳道M.Marker：泳道（1-9）为不同方法提取出的DNA扩增结果，分别为：泳道1-3.方法一；泳道4-6.方法二；泳道7-9.方法三（A.牛肉，B.羊肉，C.鸡肉）3结论根据实验提取的DNA的纯度和浓度，可以得出以下结论，试剂盒在动物组织DNA提取过程中蛋白质除去效果较好，提取的DNA纯度较高。但就组织处理的三种方法而言，直接加裂解液研磨法对各种组织的DNA提取产量和纯度都比较高，是最合适的处理方法。参考文献[1]刘欣,祝长青,王毅谦,沈赟,黄明,蒋原,周光宏.大豆转基因检测中DNA提取方法的比较研究[J].食品科学,2013,34(4):199-203.[2]代翠红,李杰,朱延明,纪巍,柏锡.不同DNA提取方法对4种重要作物DNA提取效率的比较[J].东北农业大学学报,2005,36(3):329-332.[3]李进波,盛婧,李想,潘良文,吕蓉,杨捷琳.五种DNA提取方法对鱼加工制品DNA提取效果的比较[J].生物技术通报,2014,04:43-49.