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1茯砖茶中菠甾醇的分离与鉴定作者：张XX指导教师：凌XX（安徽农业大学茶与食品科技学院，合肥，230036）摘要：茯砖茶为黑茶的一种，主要产于湖南，该茶在长期的应用实践中被证明具有降血脂等保健作用。目前茯砖茶成分的研究尚不透彻，为了阐明其保健功能的化学基础，我们首先利用有机溶剂提取，依据相似相溶的原理，利用各种溶剂的极性的差别，依次萃取，使得原提取物中的不同的极性部分，分配到相应的溶剂中，再用吸附层析法对这些部分进行分离处理，通过硅胶柱层析、凝胶柱层析、反相柱分离等方法，使待分离的化合物在此操作方法下的各个馏分尽可能的纯净，利用现代天然产物的鉴定方法，确定所分离出的物质的结构，最后得到一种白色针状结晶物质。通过核磁共振碳谱、氢谱分析，可确定化合物为菠甾醇，该成分曾在岩筋菜中发现[1]。关键词：茯砖茶柱层析核磁共振菠甾醇保健功能1前言1.1黑茶1.1.1黑茶的制作工艺与特点黑茶是我国六大茶类之一，主要包括普洱茶、茯砖茶、六堡茶。黑茶初加工包括杀青、揉捻、渥堆、干燥四道工序，相对于绿茶来说渥堆是黑茶初制独有的工序，也是黑毛茶色、香、味品质形成的关键工序，而高温汽蒸和压造成型是黑茶加工的共同特点[2]。由于特殊的加工工艺，使黑茶香味醇和不涩，汤色橙黄不绿，叶底黄褐不青，其品质风味既不同于绿茶，亦有别于黄茶，形成独具一格的品质特征；绿茶的制作工艺一般为：鲜叶、杀青、初揉、初炒、复炒、提毫、烘干，绿茶要求鲜叶为一芽二三叶或嫩芽而黑茶用的鲜叶原料较为粗老，多为立夏前后采摘的1芽4、5叶新梢[3]。21.1.2茯砖茶和普洱茶的制作工艺及其特点茯砖茶和普洱茶都属于紧压黑茶，茯砖茶多以黑毛茶或粗老绿茶为原料经汽蒸、沤堆、压制、发花、干燥等工序加工而成，其中发花是茯砖茶制造的独特工序，其目的是通过控制一定的温、湿度条件，促使微生物优势菌的生长进而产生黄色闭囊壳（俗称“金花”），“金花”是茯砖茶的主要品质特征[4]。普洱茶是以晒青绿毛茶为原料，经发水、渥堆和陈化及干燥工序加工而成，其中渥堆工艺对普洱茶品质的形成至关重要。1.1.3普洱茶和茯砖茶中的主要化学成分及其功能研究进展到目前为止，国内外对普洱茶中成分的研究很少，周志宏、林智等从不同产地的普洱茶中分离鉴定出的化合物共有22种，其中只有四种相同，即：简单儿茶素（表儿茶素、儿茶素、没食子儿茶素）、简单酚性化合物（山奈酚、槲皮素）、黄酮类化合物（杨梅素）和黄酮类配糖体（山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖甙）[5][6][7]。其中没食子酸含量最高（9.01mg/g），没食子酸，即3，4，5-三羟基苯甲酸，有显著的抗氧化活性，并有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗突变等生理活性，是普洱茶的一个最具生理活性的简单酚类化合物[8][9]。另外，普洱茶还具有抗脂质过氧化、预防高脂血症、减少心脑血管疾病发生等作用，在健齿、消除口臭、抑菌、减肥方面也有保健功能。茯砖茶（产地湖南）中主要含有儿茶素（表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯）、黄酮类糖苷（三羟黄酮醇-芸香糖苷、栎皮酮醇-己糖-鼠李糖-鼠李糖苷、杨梅酮醇-己糖-鼠李糖-鼠李糖苷、杨梅酮醇-己糖-己糖-鼠李糖苷）、茶多酚（儿茶素没食子酸酯）、咖啡碱等次生代谢物质，其中没食子酸和表儿茶素没食子酸酯有减肥降脂的功效，茯砖茶还具有助消化、减肥、利尿、增强毛细血管、养胃、健胃的作用[10][11]，其中咖啡碱的刺激作用可以提高胃液的分泌量，从而增进食欲、帮助消化，也可以刺激膀胱协助利尿，利尿的同时还有助于醒酒，解除酒精毒害作用；茯砖茶中含有8—10%的茶多酚，长期饮用可增强毛细血管的韧性，防止微血管的破裂。普洱茶和茯砖茶中的一些物质结构如下：3COOHHOHOHONCNCNNOOCH3CH3H3COHOOOHHHOHOHCOOHOHOH没食子酸咖啡碱表儿茶素没食子酸酯OOHHOOHOHOHOHOOHOOHOHHHOHOHOHOOHOHOHO杨梅素表儿茶素（EC）山柰素OHOOHOHOHOOHOOHHOOHOHOHOHOOHHOOOH槲皮素没食子儿茶素山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖甙OHOOHOHHOHOHOHCOOHOHOH——表没食子儿茶素没食子酸酯本实验通过研究普洱茶和茯砖茶中的这些次生代谢物质，阐明其治病及保健的化学物质基础。1.1.3.1生物碱结构特点及其功效茶叶中的生物碱含量为3%-5%，主要有咖啡碱、可可碱和茶叶碱，他们均为黄嘌呤甲基的衍生物。含量较多的是咖啡碱，其合成的前体物质是可可碱，咖啡碱易溶于水，在273nm处有最大吸收峰，也可以和大多数生物碱沉淀剂作用生成难容物。咖啡碱是一种常用药物,它有兴奋神经和利尿作用,对血管有扩张作用,对高血压、低血压病有益,对防治胆固醇升高、动脉粥样硬化、心肌梗塞也有一定效果[12]，结构如下：4HNCNHCNHNOONCNCNNOOCH3H3CHNCNCNNOOCH3CH3黄嘌呤茶叶碱可可碱（2,6-二氧嘌呤）（1,3-二甲基黄嘌呤）（3,7-二甲基黄嘌呤）1.1.3.2茶多酚结构特点及其功效茶多酚（18%-36%）是存在与茶叶中的多元酚的混合物，主要有儿茶素、黄酮类、花青素和酚酸，其中儿茶素在茶叶中的含量为12%-24%，它是2-苯基苯并吡喃的衍生物；黄酮类的基本结构是2-苯基色原酮[13]。儿茶素等具有帮助消化、增加食欲、减少体内脂肪积累、降低胆固醇的作用,并有抑制痢疾、伤寒、霍乱、金黄色葡萄球菌等有害菌的作用,多酚类抗氧化剂还具有较强抗放射、抗衰老、抗血小板凝聚、抗动脉粥样硬化、降血压、抑癌作用[14]。结构如下：OOHOHHHOHOHR2R1ACBOHOOHOHR1OHR2R3OOAC34567812B456132儿茶素花青素2-苯基色原酮1.1.3.3糖苷结构特点茶叶中的糖苷是通过糖的端基碳连接而成的化合物，有α-苷和β-苷两种，其结构如下：α-甲基-D-葡萄糖苷β-甲基-D-葡萄糖苷51.1.3.4皂甙的结构及其功效皂甙，又名皂素、皂角甙或皂草甙，是一类结构比较复杂的糖苷类化合物，由糖链与三萜类、甾体或甾体生物碱通过碳氧键相连而构成，茶皂素是一类齐墩果烷型五环三萜类皂甙的混合物，基本结构为皂甙元、糖体、有机酸三部分组成。茶皂甙有吸湿性,味苦而辛辣,对咽喉粘膜有刺激作用,具有很强的起泡力和一定的溶血作用,有多种生理活性,在药理方面有祛痰、消炎、镇痛止咳及抗菌等作用,对治疗多种类型的水肿有特效[15][16]。1.1.3.5鞣质的结构特点及其功效鞣质又称鞣酸或单宁，是指存在植物界的一类结构比较复杂的多元酚化合物。鞣质具有多种生物活性：如收敛作用、抗菌抗病毒作用、解毒作用、降压作用、驱虫作用等[17]。1.2内含物提取、分离、鉴定的步骤与预实验原理欲研究茯砖茶中次生代谢物的治病保健作用，需对这些有效成分进行提取、分离和结构鉴定。主要步骤是预实验、系统分离、组分分离与精制、成分鉴定。预实验的原理是：根据各成分极性的不同，先系统的分成几个不同的部分，然后利用显色反应或沉淀反应，或结合纸色谱、薄板色谱，定性判断各部分中可能含有的化合物类型，再根据相似相溶的原理，极性大的成分在极性溶剂中溶解度大，极性小的成分则易溶于非极性溶剂。1.2.1提取内含物的方法及原理溶剂法，根据相似相溶的原理提取内含物的方法；水蒸汽蒸馏法，内含物可以随水蒸汽蒸馏而不溶于水或微溶于水的原理进行分离；分馏法，利用沸点不同进行分离的方法；沉淀法，利用某些植物成分与某些溶剂产生沉淀的性质而得到分离或除去杂质的方法；盐析法，是向提取液中加入易溶性无机盐至一定浓度或饱和，使一些成分在水中的溶解度降低，沉淀析出的方法；透析法，是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过的性质而进行分离的方法。61.2.2内含物的分离纯化，常用色谱法（层析法）色谱法是利用不同的物质在固定相与流动相中不同的平衡分配系数来进行的分离的一种方法，在色谱分离中，试样混合物在固定相和流动相之间连续不断地进行分配以达到平衡，不同的化合物由于它们之间的理化性质的差异，在两相中存在量也各不相同。常用方法如下：吸附柱层析法，常用的吸附剂是硅胶和大孔吸附树脂，硅胶可用于非极性化合物也可用极性化合物，如萜类、甾体、生物碱等，而大孔吸附树脂多用于皂苷、生物碱、黄酮类化合物的分离[18]。凝胶过滤层析法，其原理是凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。常用的凝胶是交联葡聚糖凝胶（Sephadex)和琼脂糖凝胶，葡聚糖凝胶是由天然高分子-葡聚糖与其他交联剂交联而成，常用的是sephadex系列，它是葡聚糖与3－氯－1,2环氧丙烷相互交联而成，如sephadexLH—20，是SephadexG—25的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质。高效液相色谱法（HPLC），主要由进样器、分离柱、检测器、记录仪组成[19]。常用反相色谱法（RPC），一般用非极性固定相（如C18、C8），流动相为水或缓冲液。适用于分离非极性和极性较弱的化合物，如：茶多酚。气液色谱法，原理是各组分在固定液中溶解能力不同，溶解度大的较难挥发，停留在柱中时间较长，前移较慢；溶解度小的前移较快。经一段时间后，各组分彼此分离。另外除了以上介绍的方法外还有纸色谱法（pc）、薄层色谱法（tlc）、高速逆流色谱等方法。1.2.3次生代谢物质结构的鉴定（光谱鉴定法），常用的四大谱是紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、核磁共振谱（NMR）、质谱（MS）。核磁共振谱，其原理是原子核在磁场中吸收一定频率的无线电波而发生核自旋7能级跃迁的现象。在照射频率确定时，同种核因在分子中的化学环境不同而在不同共振磁场强度下显示吸收峰的现象称为化学位移，其表示方法以四甲基硅（TMS）为标准物质，规定它的化学位移为零，然后根据其他吸收峰与零点的相对距离来确定他们的化学位移值。核磁共振谱仪由永久磁铁、射频振荡器、射频信号接收器、样品管组成。常用的是氢核磁共振谱和碳核磁共振谱。紫外光谱，记录有机分子在吸收紫外光(200-400nm)后产生电子振动而形成的吸收光谱，常用于研究不饱和有机物,特别是具有共轭体系的有机化合物；红外光谱，记录有机分子吸收红外光后产生化学键振动而形成的吸收光谱。质谱，质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法[20]。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。一般，MS测定采用电子轰击法（electronimpactionization，简称EI），故称EI-MS，测定EI-MS时，需要先将样品加热汽化，使之进入离子化室，而后才能电离，因此容易发生分阶段的化合物或难于汽化的化合物，如醇、糖苷等，往往测不到分子的离子峰；而一些大分子物质，如糖的聚合物也难于汽化而无法测定；另外，ESI-MS也较为常用，是采用电喷雾，ESI为电离源。2实验部分2.1材料与方法2.1.1主要仪器数显恒流泵，BT—100B型，上海青浦沪西仪器厂产品；旋转蒸发仪，CCA—1110型，日本生产；电热板，DB—2型，国华产品；核磁共振仪，av400型，bruker公司产品。2.1.2内含物的分离纯化硅胶吸附色谱柱为实验室自装，玻璃柱（D6*100cm），填料选择安徽良臣硅源材料有限公司生产的200—300目柱层层析硅胶，采取湿法装柱，洗脱液选择（三8氯甲烷）：（甲醇）=98：2洗脱，用500ml试剂瓶收集洗脱液，正相板检测后，将目标产物混合、浓缩即可；反相色谱柱选择YMC公司生产的50um球形反相硅胶。2.2实验步骤2.2.1样品的粗提取2.2.1.1样品提取物的制备取1.8kg的茯砖茶经过粉碎后，置于玻璃制的提取罐中，以70%丙酮冷浸，经过两天的浸泡，将所得溶液合并放置旋转蒸发仪浓缩，加入适量水