毕赤酵母表达研究进展

利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11.彭毅，杨希才，康良仪。影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。生物技术通报2000，4：33-3612.113CreggJM.TschoppJFStillmanC,etal.High-levelexpressionandefficientassemblyofhepatitisBsurfaceantigeninthemethylotrophicyeastpichia.pastorisBio/Technology,1987,5:479-48513.SreekrishmaK,NellesL，PotenzR，etal.High-levelexpression,purification,andcharacterizationofrecombinanthumantumornecrosisfactorsynthesizedandcharacterizationinthemethylotrophicyeastpichia.pastoris,Biochemistry,1989,28:4117-412514.SiegelRS,BuckholzRG,ThillGP,etal.Productionofepidergrowthfactorinmethylotrophicyeastcells,InternationalPatentApplication,1990,PublicationNo:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。巴斯德毕赤酵母表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷，弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处。该表达系统具有强有力的醇氧化酶基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；同时作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性。此外，该酵母菌营养要求低、生长快、培养基廉价，易于进行操作和培养；其高密度发酵技术业已成熟，便于工业化生产；表达量高，许多蛋白可达到每升克级以上水平；表达的外源蛋白可分泌到胞外，分泌的内源蛋白少，外源蛋白分离纯化简便；外源基因通过质粒整合到基因组上，基因工程菌株遗传稳定性好；胞内表达蛋白的分选和区域化，增加了表达蛋白的稳定性，减少表达产物对宿主菌的毒害作用；糖基化程度低，与酿酒酵母相比，巴斯德毕赤酵母不产生过度的糖基化；所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。2毕赤酵母表达宿主菌毕赤酵母是甲醇营养型酵母的一种，能在甲醇为惟一碳源的培养基上生长。甲醇能诱导其表达甲醇代谢所需的酶,如AOX、二羟丙酮合成酶（NDHAS）和过氧化氢酶（catalase）,表达的C)b和c+C%的含量甚至可达到总细胞蛋白的60%-80%。而以葡萄糖、甘油或乙醇为碳源时，AOX几乎不表达。AOX的合成是在转录水平调控的，其基因启动子为诱导型。目前主要有3种表达宿主菌,它们之间的区别在于AOX1个或2个基因的缺失，而造成对甲醇利用能力高低的变化。据甲醇利用能力的改变,可将毕赤酵母分成三种表现型。SMD1168和GS115菌株含有AOX1基因,这种菌株能快速利用甲醇作为碳源和能源,能在甲醇培养基中以野生型速率生长,因此称为甲醇快利用型菌株(Mut+);KM71菌株虽不含有AOX1基因,但含有AOX2基因,AOX2基因与AOX1基因同源性92%,其编码的蛋白与AOX1基因编码的蛋白有97%同源性,能缓慢利用甲醇,这类菌株为甲醇慢利用型菌株(Muts);MC100-3菌株因AOX1和AOX2同时缺失,不能在甲醇培养基中生长,这类菌株为甲醇不利用型(Mut-)。三种表型菌株在AOXl启动子调控下均可诱导外源蛋白的表达。各种毕赤酵母表达菌株(表1)均来自于对野生菌株NR-RL-Y11430的改良。SMD1168、SMD1165和SMD1163菌株为蛋白酶缺陷型菌株,这类菌株基因组中缺失编码蛋白酶A(pep4)和(或)编码蛋白酶B(prb1)的基因[1]。SMD1168编码pep4的基因缺失,这大大降低或消除蛋白酶A和羧肽酶Y的活性,并部分降低了蛋白酶B活性;SMD1165编码prb1的基因缺失使该菌株蛋白酶B活性的丧失,而SMD1163菌株编码pep4和prb1的基因均缺失,其结果是大大降低或清除了这三种酶活性[2]。蛋白酶缺陷型菌株减弱了蛋白酶对外源蛋白的降解作用,特别适用于分泌型表达。毕赤酵母表达载体表达载体主要是由启动子、终止子、外源基因克隆位点、选择标记、报告基因和复制起点等元件构成.毕赤酵母表达载体包括自我复制型的游离载体和整合型载体，但以整合型载体为主。常见的整合载体又分为胞内表达和分泌表达2类。胞内表达的载体有pPIC3,pPIC3K,pPIC3.5K,pHIL-D2,pPICZA,pPICZAB,pPICZAC等；分泌表达的载体有pPICZa、pPIC9和pPIC9K,PACO815,pHIL-S1等。摘要在大肠杆菌这一传统表达系统被频繁用作研究各种基因表达时，一种新型且有效的基因表达系统—甲醇酵母正逐渐引起人们的注意。此系统不仅具有高表达、高稳定、高分泌的特点，而且其宿主甲醇酵母—巴斯德毕赤酵母（Picchiapastoris）具有高密度生长的特性。因此近年来此表达系统的研究得到迅速发展，在其中表达了多种具有商业价值的外源蛋白。本文对甲醇酵母基因表达系统的特点及研究进展作一简要综述。1甲醇酵母表达系统的特点1.1宿主七十年代巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％[1]。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降解，且不对细胞产生毒害。1.2载体巴斯德毕赤酵母的载体是整合型载体。常见的表达载体有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等。图1为一个典型的巴斯德毕赤酵母表达载体。该载体包含醇氧化酶—1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5’AOX1和3’AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3’AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5’AOX1和3’AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5’AOX1启动子控制下表达。1.3表达菌株的构建与建立酿酒酵母基因工程表达系统类似，构建巴斯德毕赤酵母表达菌株的基本方法如下：(1)经典遗传学操作方法（如突变体分离、互补分析、回交和单孢分析）；(2)分子遗传学方法（如DNA转化、基因置换等。[3]）为了获得高稳定的外源蛋白表达菌株，巴斯德毕赤酵母表达载体连同外源基因通过同源重组整合至宿主染色体基因组座位上。对于图1所示的表达载体pPIC3，能以两种方式整合至染色体上。一种是在His4或5’AOX1dNA片段的单酶切位点将质粒载体切成线性，通过单交换整合进染色体（图2A、B）。另一种用BglⅡ酶切此质粒载体，释放出包含AOX1末端序列的表达盒，与宿主染色体上的AOX1基因发生一步基因置换（图2C），这样得到的表达菌株为AOX1缺陷型，它们代谢甲醇的速度明显减慢，但有时表达外源蛋白的水平却比野生型菌株高得多，尤其表现在摇瓶培养β-半乳糖苷酶[3]、转化酶(invertase)[4]和乙肝病毒表面抗原上[5]。与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。多拷贝表达菌株的获得方式有两种。一种是利用SDS-PAGE电泳[6]、免疫杂交[7]或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中[8]，而后再通过交换整合到受体染色体上。在发酵罐培养的产物选择压力下此两种方式获得的多拷贝表达菌株被证明是稳定的。1.4巴斯德毕赤酵母表达菌株的生长经同一表达载体转化后分离得到的不同转化子，其产物的表达水平不同。即使受体染色体上重组了相同数目的表达盒。转化子的表达情况也不近相同。因此，为了获得高产量的表达菌株，需要对大量的转化子进行筛选。小量摇瓶培养无疑是筛选转化子简便而有效的方法。但是由于在摇瓶培养中巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确地反映罐发酵中的表达情况，使之成为令人头痛的问题。主要原因是在摇瓶培养中，培养液的pH值无法控制，培养物通气不充分及无法控制添加碳源的最适速率。但是为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵罐培养条件的实验，仍需摸索表达菌株的摇瓶培养条件，使其产物的表达量与预期的发酵罐培养结果相近。巴斯德毕赤酵母表达菌株的培养条件包括：适宜的培养液缓冲系统及适当的发酵液pH值，以降低蛋白酶的活性；最大的通气量；添加适量的蛋白胨或酪蛋白水解物以避免产物被蛋白酶降解并为外源蛋白的合成及分泌提供氨基酸和能量。在甘油作碳源的培养液中，细胞迅速生长，菌体密度逐渐增大，但此时外源基因的表达被完全抑制。而当甘油缺失或被完全消耗时，甲醇被添加到培养液中，诱导产生外源蛋白。此阶段菌群生长迟缓，但产物表达旺盛。经研究人员的努力，多种生产外源蛋白的巴斯德毕赤酵母的分批和连续培养都有成功报道。1.5外源蛋白的分泌巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白分胞内的表达和分泌到胞外两种方式。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。当然，利用外源蛋白本身的信号序列很方便，因为基因的全部编码序列可以插入到表达载体的单个或多个克隆位点。但在许多例实验中，巴斯德毕赤酵母不能利用外源基因本身的信号序列引导分泌。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号——α交配因子引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌，如鼠表皮生长因子，产量达0.45g/L[11]。2巴斯德毕赤酵母中外源蛋白的表达随着巴斯德毕赤酵母表达系统的不断发展和日趋完善，许多具有商业价值的外源蛋白在此系统中得到了成功表达。由于其表达载体上醇氧化酶基因强启动子的作用，外源蛋白的表达量很高，如破伤风毒素蛋白的产量达12g/L。外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达分胞内表达和分泌到胞外两种方式。我们将在巴斯德毕赤酵母中表达外源蛋白的情况总结如表1。国内在巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白方面的研究近年刚刚起步。国家海洋局第三海洋所的陈丹等人[12]在此酵母中表达了鲈鱼生长激素，表达量为100mg/L。如今，美国Invitrogen公司已有该表达系统试剂盒出售，因此要利用此系统表达一个外源