毛细管电泳技术在检测分析中的应用

2011-12-31毛细管电泳技术及其在检测分析中的应用分析化学1/4毛细管电泳技术及其在检测分析中的应用摘要：毛细管电泳技术(CE)作为现今一种主要的分析技术，凭借其高效、灵敏、快速、设备简单、广泛适用性等特点，广泛应用于各个领域。本文简要概述了CE技术的原理及特点，并简述了它在环境分析、食品分析、药物分析、生物大分子分析等各个领域的应用。关键词：毛细管电泳；分析；应用1.毛细管电泳技术简介1.1产生与发展毛细管电泳技术（CapillaryElectrophoresis,CE）是一种在电泳技术的基础上发展的一种现代分离技术。电泳技术作为一种分离技术已有近百年历史，1937年A.Tiselius首先提出：传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热。1967年，Hjerten最先提出了毛细管电泳的雏形，即在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳。但他并没有完全克服传统电泳的弊端。直至1981年Jorgenson和Lukacs提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离,这时现代毛细管电泳技术真正产生。1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支：胶束电动毛细管色谱（MEKC）。1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年，Cohen发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色谱等优点，其突出特点是：（1）所需样品量少、仪器简单、操作简便。（2）分析速度快，分离效率高，分辨率高，灵敏度高。（3）操作模式多，开发分析方法容易。（4）实验成本低，消耗少。（5）应用范围极广。自1988年出现了第一批毛细管电泳商品仪器，短短几年内,由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求,得到了迅速的发展。1.2毛细管电泳技术的简单原理毛细管电泳的基本装置是一根充满电泳缓冲液的毛细管（如图1），和与毛细管两端相连的两个小瓶。微量样品从毛细管的一端通过“压力”或“电迁移”进入毛细管。电泳时，与高压电源连接的两个电极分别浸人毛细管两端小瓶的缓冲液中。样品朝与自身所带电荷极性相反的电极方向泳动。各组分因其分子大小、所带电荷数、等电点等性质的不同而迁移速率不同，依次移动至毛细管输出端附近的光检测器，检测、记录吸光度，并在屏幕上以迁移时间为横坐标，吸光度为纵坐标将各组分以吸收峰的形式动态直观地记录下来。图1图21.3毛细管电泳技术的分离模式（1）毛细管区带电泳（CapillaryZone2011-12-31毛细管电泳技术及其在检测分析中的应用分析化学2/4Electrophoresis,CZE）用以分析带电溶质。为了降低电渗流和吸附现象，可将毛细管内壁涂层。CZE是最基本也是最常见的一种操作模式，应用范围最广，可用于多种蛋白质、肽、氨基酸的分析。（2）胶束电动毛细管色谱（MicellarElectrokineticCapillaryChromatography,MECC）在缓冲液中加入离子型表面活性剂如十二烷基硫酸纳，形成胶束，被分离物质在水和胶束相（准固定相）之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。MECC是唯一一种既能用于中性物质的分离又能分离带电组分的CE模式。（3）毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresis,CGE）在毛细管中装入单体，引发聚合形成凝胶。CGE分凝胶和无胶筛分两类，主要用于DNA、RNA片段分离和顺序、PCR产物分析及蛋白质等大分子化合物的检测。（4）亲和毛细管电泳，在毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基，以亲和力的不同达到分离。可用于研究抗原-抗体或配体-受体等特异性相互作用。（5）毛细管电色谱，（CapillaryElectrochromatography,CEC）是将高效液相色谱（HPLC）的固定相填充到毛细管中，或在毛细管内壁涂布固定相，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程。此模式兼具电泳和液相色谱的模式。（6）毛细管等电聚焦电泳（CapillaryIsoelectricFocusing,CIEF）是通过内壁涂层使电渗流减到最小，在两个电极槽分别装酸和碱，加高电压后，在毛细管内壁建立pH梯度，溶质在毛细管中迁移至各自的等电点，形成明显区带。聚焦后，用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值使溶质通过检测器。CIEF已经成功用于测定蛋白质等电点，分离异构体等方面。（7）毛细管等速电泳，（Capillaryisotachophoresis,CITP）采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离。（8）CE/MS联用，CE的高效分离与MS的高鉴定能力结合，成为微量生物样品，尤其是多肽、蛋白质分离分析的强有力工具。可提供分子量及结构信息，适于目标化合物分析或窄质量范围内扫描分析，如多环芳香碳氢化合物（PAH）、寡聚核苷酸分析等。2.毛细管电泳技术的应用毛细管电泳（CE）由于具有着上述独特优点，现已被广泛应用于环境分析、食品分析、药物分析、生化分析等领域。分析的对象可以是离子、小分子、生物大分子乃至高分子、粒子和活体单个细胞。含量测定范围可从常量到微量乃至几个分子的测定。应用极其广泛。2.1环境分析毛细管电泳在环境分析中主要应用于水样中阳离子和阴离子的分析、多环芳烃的分析、农药残留量的分析、多氯联苯的分析、金属离子和无机阴离子的分析、DNA加合物的测定、酚类化合物分析等几个方面。以金属离子分析为例。传统的金属离子仪器分析方法包括原子吸收法、离子色谱法、液相色谱法、电化学法和质谱法。上述方法中有的需要消耗大量的溶剂和时间，有的预处理方法复杂，有时甚至会造成待测成分在预处理过程中严重受损。毛细管电泳（CE）因其溶剂消耗量小、分离效率高逐渐受到重视。石美，高庆宇等人开发了一种将毛细管电泳用于含水溶性金属离子样品分离检测的间接紫外法。在8.5min内实现K+，Ba2+，Ca2+，Na+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Cd2+，Li+和Cu2+10种金属离子的基线分离，各金属离子的检测限、线性范围和标准工作曲线相关系数分别为0.01～0.21mg/L，0.06～60mg/L和0.5～0.9998之间，标准样品回收率为9.64%～102.6%，5次测定的相对标准偏差在0.8%～4.5%之间。并证明该法可以用于这些金属离子在复杂基质中的常规检测。2.2食品分析毛细管电泳在食品分析中主要应用于蛋白质、氨基酸、生物胺、维生素、碳水化合物、无机离子、有机酸等的含量测定以及食品添加剂、残留农药、生物毒素的分析。王茜和王广增对毛细管电泳技术在食品添加剂分析中的应用进行了综述，例如：毛细管区带电泳(CZE)可分离和测定浓缩果汁、软饮料、果酱、蚝油和人造黄油中的山梨酸和苯甲酸，检测限约0.06mg/L，相对标准偏差(RSD)为0.9%-4%。为了减少基质干扰，在分离之前用固相萃取柱(SPE)对样品进行预处理，检测限低于0.5m/L。唐吉军等人用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术从随机寡核苷酸文2011-12-31毛细管电泳技术及其在检测分析中的应用分析化学3/4库中筛选获得特异识别蓖麻毒素靶分子的适配子，将毛细管电泳技术作为分离手段引入到SELEX筛选中，利用毛细管电泳高效的分离能力使得筛选周期大大缩短。2.3药物分析从1987年首次将毛细管电泳技术用于药物分析以来，已有约200篇论文报道CE用于几百种药物及各种剂型中主药成分分析、相关杂质检测、纯度检查、无机离子含量测定及定性鉴别等药物常规分析。进来对于中药成分分析以及手性对映体分离分析越来越成为关注的焦点。对中药及其制剂的成分分析目前较常用的方法为毛细管区带电泳和毛细管胶束电动色谱法。中药成分一般采用水煮或用醇等有机溶剂提取，其萃取液中常见的药效成分为生物碱、黄酮、香豆素、有机酸及甙类。现已有关于芍药、人参、黄芩、黄连、黄柏、麻黄、大黄、甘草等中药材以及葛根汤、小柴胡汤、加味逍遥散等几十种中药复方及其制剂中某些药效成分分析的报道。手性对映体分离有巨大的应用价值，已引起世界各国普遍关注，成为现代高科技的一个重要领域。我国已将其列为自然科学基金资助的重大项目∀。由于CE的分离效率高，分离模式多和分析时间短的优点。所以CE分离手性对映体的应用发展得很快。例如第八届国际高效毛细管电泳学术年会共有362篇论文，其中手性对映体分离就有31篇，占8.6%。可用CE间接分析方法进行手性对映体分离，即将手性对映体和某些试剂反应后利用两对映体产物间微小差别用CE分离。但此法存在许多问题。用CE直接分离手性对映体是发展方向。在机理上已提出手性对映体分离的数学模型。可用5种模式即CZE、MECC、毛细管凝胶电泳、毛细管电色谱和毛细管等速电泳等进行分离。常用的手性选择剂有环糊精、冠醚、手性选择性金属络合物、胆酸盐、手性混合胶束、蛋白和糖等。国际高效毛细管电泳学术年会会议论文除介绍一些手性对映体分离实例外，主要集中在机理研究。如手性分离中表面反应的机理、结合常数的测定、背景电解质和外加有机溶剂的影响以及MECC中表面活性剂结构、溶质结构对分离的影响等。如Vigh等基于多种平衡推导出的计算公式，可研究PH值，手性选择剂浓度，电渗流等对分离及选择性的影响。2.4生物大分子分析CE主要在生物大分子方面主要应用于核酸分析、蛋白质分析、糖类分析几个方面。其中最为热门的要数对于DNA的分析。CE技术运用于DNA分析最首要的优点是可以实现微量DNA的检测。核酸是基本遗传物质。用MECC在40min以内分离出14种核酸成分。采用动态pH梯度将CZE扩展到具有不同pK值混合物，分离出11种嘌呤和嘧啶混合物。从水解的RNA中用CZE在5min以内分离出4个核糖核苷酸异构体。当使用LIF检测器时，它可以从几十纳克的固相硅胶树脂中检测到所吸附的几个纳克或几个皮克的DNA。因此，从若干白细胞、癌细胞或几微升血液中提取的DNA可直接为CE所定量，用于PCR扩增。当CE与PCR微型装置相连时，可检测到2个拷贝的起始模板经20次循环后的扩增产物，这也是所有报道中CE的微量检测极限。而且，当使用聚丙烯酰胺填充的毛细管、绿色氦/氖激光光源时，利用内插试剂溴化乙锭(EB)，可以检测到几个皮克的双链DNA—EB复合物，而在琼脂糖凝胶上用EB染色不能分辨。因此，cE极大地提高了DNA的检测灵敏度，使检测所需样品量剧减，为对DNA微芯片进行在板电泳提供了可能。由上，CE又发展出对于DNA片段的分离以及基因突变的检测，此外，在毒品、血清蛋白和血色素变异的分析中，CE已成为了常规的诊断手段。这使它的适用范围从科研院校扩展到医药卫生和国家安全系统，再延伸到体育界的兴奋剂检测等领域。在检验检疫领域，CE灵敏、快速的优势使它成为饮用水、食品、生物医学中病原诊断的最佳工参考文献[1]王茜,丁晓静,王心宇,等.毛细管电泳法快速测定保健食品中免疫球蛋白G[J].分析化学,2006,34(7):1161-1164.[2]高文惠,裴红,杨桂君.毛细管电泳在食品添加剂检测中的应[J].食品与生物技术学报,2010,29(3):326-330.[3]杨晓云，王立世，莫金垣，等.毛细管电泳安培法检测酚类化合物[J].分析试验室.2001,20（3）:69—72.[4]王义明,罗国安,魏伟,关燕华.毛细管电泳的原理及应用(第五讲)毛细管电泳在医药领域中的应用.色谱.1997,15(6):494-498.[5]罗国安,王义明,毛细管电泳的原理及应用（第二讲）毛细管电泳的原理及应用.色谱.1995,13（6）:437-440.[6]罗国安,王义明,王如骥,王清刚.毛细管电泳的原理和2011-12-31毛细管电泳技术及其在检测分析中的应用分析化学4/4应用(第六讲)CE在DNA、糖和离子分析中的应用.色谱,1998,16（1）:38-43.[7]舒建华,郑少琴,梅林,林勇.药物分析中的毛细管电泳应用[J].