水华微囊藻分离及其鉴定技术研究进展

水华微囊藻分离及其鉴定技术研究进展聂晶晶1，铁程2，金玉2，殷丽萍2，李元1，杨良2摘要：我国是蓝藻水华分布最广，受影响最大的国家之一。水华的普遍发生，使水体的感官性状恶化，水体自净能力降低。有毒蓝藻的研究也是目前热点之一；微囊藻毒素(Microcystins，MC)是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。对其研究十分必要。但在微囊藻分离培养以及分离后纯种的鉴定研究方面还存在许多难点。本文介绍近几年来在水华蓝藻分离培养和鉴定技术方面的研究进展。关键词：分子鉴定蓝藻水华分离培养前言：湖泊、水库和河流中接纳过多的氮和磷等营养物质，使水体的生态结构与功能发生变化，导致藻类特别是蓝藻(Cyanobacteria)的异常繁殖生长而出现的蓝藻水华现象。当蓝藻水华严重时，水面形成厚厚的蓝绿色湖靛，散发出难闻的气味。不仅影响人的感官、破坏了健康平衡的水生生态系统，而且因藻细胞破裂后释放出了多种藻毒素而对人和动物的饮用水安全构成了严重的威胁。世界上25％～70％的蓝藻水华污染可产生藻毒素，在已发现的各种不同藻毒素中，微囊藻毒素(Microcystins，MC)是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。纯种藻的分离和培养十分必要，然而藻类的分离培养有很多因素制约，如藻细胞普遍比较小，而且很多藻细胞聚集在一起也对分离造成了很多的困难。很多科研单位从藻种提供单位购买，不仅增加了研究支出，而且特异性的地区藻类的进化和遗传有很大差异。科研单位有必要独立解决藻类的分离培养技术。分离培养的纯种藻需要定性说明是什么藻，所以藻的鉴定也是十分必要的。1.藻类分离培养藻类的分离方法就是为了提供纯种藻作为基础和应用研究的材料，也是今后开展藻类增长潜力试验(简称AGP试验)不可缺少的手段之一。藻类培养首先要有藻种。从天然水域的混杂生物群中，用一定方法把所需藻类个体分离出来，而获纯种培养。这种方法称为藻种分离和纯化，又称纯培养法。真正的“纯种培养”是指在排除包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。这是进行科学研究不可缺少的技术，而在生产性培养中不排除细菌的称之为“单种培养”。要想从水体中分离出试验所需的纯种藻必须经预备培养；藻种分离；纯种培养；保种这四个步骤。1.1藻种分离细胞藻类的分离方法按照培养载体分为：固体培养基法、液体培养基法。1.1.1固体培养基法(1)半固体稀释倒平板法：先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释，然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至35℃左右的琼脂培养基（200mL培养基加入0.5g琼脂）混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含藻的琼脂平板，保温培养一段时间后可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或者琼脂培养基中就可出现分散的单个藻种，然后挑取该单个藻株，或重复以上操作数次，便可得到纯的单种藻。(2)涂布平板法[1]：由于将含藻材料先加到较热的培养基中再倒平板易造成某些热敏感的藻类死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧的藻类被固定在琼脂中因缺乏氧气而影响生长，因此更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已溶的培养基倒入无菌培养皿中，冷却后将一定量的某一稀释度的样品悬液滴在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将藻液均匀分散至整个平板表面；还有种做法是把稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中（如医用喉头喷雾器），打开培养皿盖，把藻液喷射在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。经培养后挑取单个藻株。(3)平板划线分离法：用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，以无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐渐分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分开，经培养后，可在平板表面得到单种。1.1.2液体培养基对于有些藻类用固体培养基分离效果通常是满意的，但是有些藻类需要用液体培养基分离来获得纯培养。培养微囊藻常用液体培养基有HGZ、MA[2]、BG11等。单细胞藻类单种液体培养基分离常用下列三种方法：微吸管分离法，水滴分离法，稀释分离法[3]。(1)微吸管分离法：将稀释适度的藻滴水样，滴于凹玻片上。在显微镜下用微吸管挑选要分离的藻体，认真仔细地吸出放入另一个凹玻片上，在显微镜下观察该滴藻液中是否达到纯分离目的，如不成反复几次，直至达到分离目的为止。然后移入经灭菌的培养液中(一般在20mL试管中装入培养液2～4mL)进行培养。此法操作技术要求高，要细心。往往吸取一个细胞，要反复几次才能成功。因为微囊藻个体较大，一般这种方法比较常用，但对操作者要求较高。(2)水滴分离法：用微吸管吸取稀释适度的藻液，滴到消毒过的载玻片上，藻液水滴尽可能小些，要求在显徽镜低倍镜视野中能看到水滴的全部或大部。一载玻片滴2滴，水滴作直线排列，互相间隔一定距离，在显微镜下详细观察每一滴藻液。如果一滴藻液内只有一个或几个所需要分离的同种藻类细胞，无其他生物混杂，即用吸管把这一滴藻液冲入装有培养液并经过灭菌的三角瓶中，如不成反复几次直至成功。水滴分离法简便易行，适宜于分离在培养液中占优势的藻种。(3)稀释分离法：把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。通过稀释到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。首先把水样稀释到每一滴含有一个左右的生物细胞，在稀释过程中配合显微镜检查，调节稀释度，然后准备装有1/4容量培养液的试管20支，每一试管加入稀释适宜水样一滴，摇匀，进行培养。待藻类生长繁殖达一定浓度时，再检查是否达到分离目的，若未达到，再重复做。此法操作简单易行，但有一定程度盲目性，比不上水滴分离法效果。纯种培养将毛细玻璃管吸取的单个藻体，用吸嘴吸入装有50mL培养液的100mL三角瓶中，用灭菌纸封口放入培养架上进行培养。当藻增多长大后，用灭菌环取1滴藻液镜检，如果有几种藻同时存在，要重新分离，直到分离出纯种藻体。在实际操作中，也可结合两个方法，先固体培养基，优点是缩短培养周期，固体培养也容易挑取，再用液体培养基法，进一步纯化。2.藻种培养将确定为单种藻并且达到对数生长期的蓝藻移进l3号(112um)浮游植物网，用去离子水洗净后，移到试管中，用50W超声波处理30s，将群体打碎，再按照上面的分离纯化方法进行操作，直至得到无菌株。2.1保种保种为了保证分离出来的单细胞藻种的成活，需定期将它移入新的培养液中，待藻种在新的培养液中长成后，便可将它放在低温、弱光下保存。保种时需要注意防止藻液污染。通常用液体培养基保存藻种接种一次只能保存1～2个月，而用固体培养基保存藻种接种一次可以保存半年到一年。保种用的固体培养基的营养物浓度应高于液体培养液，一般可增加一倍。琼脂量为1％～1．5％,而且现在对于藻类也可适当的减少琼脂量，使其制成半固体培养基，实践中也获得不错的效果。2.2大量培养微囊藻培养包括接种、培养、采收等。（1）接种：一般要求选取生活力强、生长旺盛藻种。可先将浓缩藻种用连续稀释法，制备一定浓度的悬浮藻液，然后接入培养容器。接种时注意藻种和培养液比例要适当，使藻细胞在新培养液中达到一定数量。使一开始培养，藻类在培养液中占优势，另一方面还可缩短培养周期，这是培养得到成功的经验之一。在环境条件不很适合情况下，更需提高接种量。一般所用藻种浓度，根据藻类体积大小，每毫升30万～300万个，采用1∶2～1∶5的比例。还需注意接种时间，在自然光条件下，最好在上午8～10时，不宜在晚上。（2）培养管理：主要是使已接种培养物在相对稳定适宜环境中大量繁殖生长。要注意以下因素：1）二氧化碳浓度：在开放式不通气方法培养中，搅拌是十分必要的，可以增加水和空气的接触面，使空气中二氧化碳溶解到培养液中，而且帮助沉淀藻类细胞上浮获得光照。在通气培养中，培养液内应维持二氧化碳浓度在0.1～5％之间。2）光照强度：利用太阳光源培养时，一般在室内培养可放在近窗口地方，防止强直射光照射或利用人工光源（60～100Ｗ电灯或日光灯），需1500～3000Ix。3）温度：适温一般在10～30℃之间，最适温常为20～25℃。若在室外培养，夏季中午高温，冬季早晚低温，常造成不利影响，需设法调节。4）无机营养：应不断添加新鲜培养液，及时补充被藻吸收后减少了的某些元素。5）注意pH变化：变动过大，可用酸、碱调节。6）适当控制培养物中藻细胞浓度：过高会引起光照和无机营养不足，并导致pH上升。一般控制在0.3g（干重）/L范围内。7）及时观察和检查藻类生长情况：可以通过培养物呈现的颜色、藻类细胞运动情况、是否有沉淀附壁、菌膜及敌害生物污染迹象等观察而了解一般的生长情况。藻种培养每半月进行一次全面显微镜检查。大量培养中发现有不正常现象，应立即镜检，目的有两个：了解藻细胞生长情况，并检查有无污染。（3）采收：通常在培养物细胞浓度达到干重0.4～0.5克/升时，即可采收培养总量1/3的藻体。采收时，先搅拌培养物，取出1/3量藻液，置于沉淀缸中，加入2％～3％明矾或6％饱和石灰水。约1～2小时，藻细胞即可完全沉淀，取出沉淀，离心、浓缩、冻干。3.微囊藻鉴定方法藻类在监测湖泊、水库等水体的水质状况时起着极其重要的作用，国内外已广泛应用藻类作为生物监测、评价水质污染程度的重要指标。3.1物理方法藻类识别统计的物理方法原理是根据不同类藻都有表明其身份的特征，如形态学上形态大小、色素、色素体、贮藏物质等的差别来辨别不同种的藻类细胞，微囊藻的物理方法分辨主要是根据形态上的空间布局和群体的构型不同。目前从传统的碘量法发展了很多种方法。（1）离心沉降法[3]：准确量取5O～100mL水样于离心管，4000rpm离心10min，小心倒扣弃去上清液，用滤纸吸去管口余水，向管内加入少量生理盐水，旋涡振荡洗下粘附在管壁的藻细胞，定容至1～2mL，计算浓缩倍数，用于下一步镜检。离心沉降法检测水中藻类数目与传统的碘液固定法结果没有显著差异，并具有①快速检测(操作熟练者半小时可以出结果)；②显微图像清晰(活藻体，色素体等细胞结构没有破坏，易鉴定)；③所需水样品量少(50～100mL)；④不需用化学药品等优点。（2）显微彩色图像识别法[4]：显微彩色图像处理在将制备的样本置于显微镜载标明藻类的种类和数量后，经1O0倍油镜显微放大，通过CCD摄像将获取的模拟图像信号输入图像采集卡中，并转换成Windows位图格式数字图像，保存在计算机中以备分析。在识别统计中，将待测样品的特征信息通过CCD摄像获得的模拟图象通过计算机终端转化信号，与计算机中的图象信息进行对比。（3）免疫电镜技术识别：大部分藻类都具有蛋白核(Pyrenoid)结构。最近国外研究资料认为蛋白核可能涉及光合功能和CCM(CO2浓缩机制)，Miyamura等研究显示叶绿体DNA位于蛋白核中。可见，蛋白核在藻类叶绿体分子生物学、细胞生理及生物进化等方面都具有重要作用。为此，应用电镜技术对几种藻类蛋白核超微结构进行了观察，应用对Rubisco和Rubisco活化酶进行分子定位。利用制备的单克隆抗体和藻类表面抗原相结合的原理，可鉴别具有特定抗原的表面蛋白。利用电子显微镜观察藻类细胞的微观结构来鉴定。还可以根据蛋白与特色染色剂进行特征染色的特性，利用特定抗原的表面蛋白结合颜色的差异进行鉴别也是未来发展的方向。3.2分子生物学方法（PCR）传统的方法耗时长、劳动强度大、效率低，还存在着人为误差，非专业人员无法从事；并且环境对藻类的形态有很大的影响，鉴定出具体的种存在的困难较多都此需要从分子上找出直接的证据以鉴别。1985年由美国的莫里森发明了[1]PCR技术，该技术以其简便、快速、灵敏、特异的特点，受到了分子生物学家的普遍重视。用于微囊藻毒株的鉴定和检测也是刚刚兴起方法。3.2.1蛋白基因序列的测定鉴别微囊藻编码蛋白的基因也可用来构建系统发生树，但由于这些基因存在的主要目的是其编码的蛋白质在生物中所起的生理功能，因此只要蛋白质的组成或蛋白质的保守结构域不发生变化，他们的就不会被淘汰。因此，功能性蛋白的基因能被用于进行更精细的藻种鉴定，在