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第三章细菌的生长和遗传变异第一节细菌的生长及其特性细菌吸收营养物质以后，在酶的催化下进行各种新陈代射反应，如果同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断增加，表现在细胞自身就是体积或重量的不断增加。这种现象叫生长。生长到一定阶段，细菌以二分裂的方式形成两个子细胞，这就是繁殖，其持征是细菌个体数增加。细菌的生长繁殖很快，适宜的环境下每隔20～30min分裂一次。细菌有没有年轻、年老之分呢？回答是肯定的，但是细菌的所谓菌龄和人的老年、中年、幼年的概念不同。人是按出生之时算起，年纪越小越年轻，越大就越老。细菌则不然，细菌是以分裂法进行繁殖的，一般繁殖一代的时间，只要20～30min，而且在一大群细菌中也无法区分每个细菌的年老年轻。因此细菌的所谓年龄是指一群细菌在一定的环境条件下生长而表现出来的待征。换句话说，描述细菌的生长往往用群体繁殖和生长所表现出来的特征来代表。在介绍细菌的生长特性之前，先介绍细菌的生长测定方法。一、细菌生长测定方法(一)直接测定直接测定是常用的细菌生长测定方法，其特点是测定过程快速，但不能区分细菌的死活。根据不同的测定方法原理，可以分成以下几类：1、显微镜直接计数法显微镜直接计数法又称全数法。它又分成下述几种：(1)涂片染色法将已知体积的待测样品，均匀地涂布在载破片的已知面积内，经固定染色后计数菌数。一般藉助目测微尺的直径标准来计算细菌的数量。(2)计数器测定法采用特殊的细菌或血球计数器进行测定。操作过程是取一定体积的待测细菌样品放于计数器的测定小室与载玻片之间，由于测定小室的体积是已知的，因此根据得到的计数值就可以计算出细菌含量。(3)比例计数法将待测样品溶液与等体积的血液混合，然后涂片，在显微镜下测定细菌与红血球数的比例，因血液中的红血球数已知(男性400～500万个／mL，女性350～450万个／mL)，由此可以测得细菌数量。2、比浊计数法这是测定悬浮细胞的快速方法。其原理是细菌细胞是不透光的，光束通过悬浮液时会引起光的散射或吸收，降低透光度，在一定范围内透光度与溶液的混浊度即细胞浓度成正比，籍此可以测定细菌浓度。采用这种方法时，为了得到实际的细胞绝对含量，通常须将已知细胞浓度的样品按上述测定程序制成标准曲线，然后根据透光度或光密度值从标准曲线中直接查得细菌含量。(二)间接计数法间接计数法又称活菌计数法。它是通过测定样品中活的细菌数量来间接地表示细菌的含量。因此，这种方法不含死的细菌细胞，而且测定所需的时间也较长。它分下述几种方法：1、平板计数法将待测细菌样品先作10倍梯度稀释，然后取相应稀释度的样品涂布到平板中，或与未经融化的固体培养基混合、摇匀，培养一定时间后观察并计数生长的细菌数，最终根据细菌数和取样量计算出细菌浓度。一般计数平板的细菌生长菌落数以30～300个为宜。菌落数太多，计数时费时费力；菌落数太少，则计数结果误差太大。平板计数法是采用最广的一种活菌计数法。2、液体计数法液体计数法是根据统计学原理设计的一种方法。具体做法是；先将待测细菌样品作10倍梯度稀释，然后取相应稀释度的样品分别接钟到3管或5管—组的数组液体培养基中，培养一定时间后．观察各管及各组中细菌是否生长，记录结果，再查已专门处理好的最可能数(mostprobablenumber，MPN)表，得出细菌的最终含量。因此，这种方法又叫最可能数法或MPN法。3、薄膜计数法对于某些细菌含量较低的测定样品(如空气或饮用水)，可采用薄膜计数法。将待测样品通过带有许多小孔但又不让细菌流出的微孔滤膜，藉助膜的作用将细菌截留和浓缩，再将膜放于固体培养基表面培养，然后类似于板计数那样计算结果。这种方法的要求是样品中不得含有过多的悬浮性固体或小颗粒。上述各种活菌计数法中，除了已所述的特点以外，还有一个共同的要求，即测定的样品中细菌必须呈均匀分散的悬浮状态。对于本身为絮体或颗粒状的细菌样品，如好氧生物处理中的活性污泥，在测定计数之前要采取预处理方法(如匀浆器捣碎等)进行强化分散。(三)重量法细菌细胞尽管很微小，但是仍然具有一定的体积和重量，因此藉助群体生长后的细胞重量，可以采用测定重量的方法直接来表示细菌生长的多少或快慢。1、测定细胞干重可采用离心法或过滤法测定。取经过培养一段时间的待测细菌样品，用离心机收集生长后的细菌细胞，或用滤纸、滤膜过滤截取生长后的细菌细胞，然后在105～110℃下进行干燥，称取干燥后的重量，以此代表细菌生长量的多少。一船．从细菌细胞的化学组分可知，干重约为湿重的10％～20％。原核细菌的细胞重量是10－15～10－11g／细胞，真核单细胞微生物重量为10－11～10－7g／细胞。水处理中构筑物内细菌生长量通常采用这种细胞干重测定法。在活性污泥法中采用的指标是混合液悬浮固体(MISS)。具体做法是：取一定体积的待测污泥样品，放于蒸发皿中干燥，然后称重。但是这种方法有个缺陷，即混合液中含有的无机悬浮物或颗粒也包含在测定的重量之中，可是这些重量并不能真正反映细菌的实际生长情况。因此，为了更确切地得到细菌生长量的结果，必须采用另外一个指标——挥发性悬浮固体(MLVSS)。其测定过程是：将已测得干重(W0)的污泥样品，放于马福炉内550℃下灼烧2h，在这样的高温下细菌中含有的各种有机物就被分解变成CO2，相H2O并蒸发掉。冷却后放入干燥器中保温至恒重并称量(W)。污泥干重W0减去最终重量W的差值就是挥发性悬浮固体重量。当然，限于测定方法的精度这仅能约略表示微生物的数量。2、细胞含氮量细菌细胞蛋白质中氮的含量比较稳定，一般在15％～17％，平均为16％。根据氮含量的测定结果，反过来可以求出细菌生长量的多少。3、DNA含量不同的细菌细胞其含有的DNA含量是不同的，但同一种细菌所含有的DNA含量却是基本一致。利用这一特性，可以通过测定DNA的含量来表示细菌的生长量。这后二种方法在细菌的生理生化研究中应用较多。(四)其它生理生化指标法细菌的生长生命活动过程中，不可避免地要吸收和消耗一些物质，同时产生和分泌另一些物质。测定这些物质的变化就可以间接地来表示细菌生长的情况。水处理中通常采用的生理生化指标有：营养物质(COD)的消耗，溶解氧的消耗(如好氧细菌的瓦呼仪测走法)，有机酸的产生，H2和CH4的产生(如厌氧细菌的生长及活性测定)。二、细菌生长特性1、间歇培养和生长曲线将少量细菌接种于一定量的液体培养基内，在适宜的温度下培养，并定时取样测定活细菌数目或重量的变化，这就是间歇培养。如以活细菌个数或细菌重量为纵坐标，培养时间为横坐标，即可画得一曲线，此曲线称为细菌的生长曲线。一般说，细菌重量的变化比个数的变化更能在本质上反映出生长的过程，因为细菌个数的变化只反映了细菌分裂的数目，而重量则包括细菌个数的增加和每个菌体的增长。图3—1就是按细菌重量绘制的生长曲线。整个曲线可分为3个阶段(或3个时期)：生长率上升阶段(对数生长阶段)，生长率下降阶段及内源呼吸阶段。在生长率上升阶段初期，细菌是在适应新的环境，一般不进行分裂，故菌数不增加，但菌体则在逐渐增大，以后很快进入迅速繁殖的阶段。在上升阶段，食料(营养物)的供应超过细菌的需要，细菌的生长不受食料数量的影响，只受自身生理机能的限制。到这一阶段的后期，生长率达到最高，这时它们分解培养基中有机物的速率也最高。科学试验说明，在这一阶段中细菌数目的对数同培养的时间呈直线关系，所以又称对数生长阶段。经过一定时间后，由于食料的减少(食料逐渐被细菌吸收掉)和对细菌有毒的代谢产物的积累，环境逐渐不利于细菌的生长，因而进入生长率下降阶段。此时的细菌生长率主要已不是受自身生理机能的限制，而是食料不足起着抑制细菌生长的主导作用了。在内源代谢阶段，培养基中的食料已经很少．菌体内的贮藏物质，甚至体内的酶都被当作营养物质来利用，也就是说，细菌这时所合成的新细胞质已不足以补充因内源呼吸(即菌体内贮藏物质、酶等一部分细胞物质的氧化)而耗去的细胞质，因此细菌重量逐渐减少。所以在这一阶段细菌重量的减少一方面是由于细菌的死亡，另—方面是由于内源呼吸。在以上3个阶段中，处于第一阶段的细菌可说是细菌的年轻阶段，列第三个阶段是细菌的衰老阶段。在年轻阶段时整个群体都是年轻的，到了衰老阶段尽管也有新分裂的细菌，但仍然属于衰老的。图3—2是按细菌数目的对数绘制的生长曲线图。曲线可分为缓慢期、对数期、稳定期和衰老期四个阶段。在开始一段细菌并不繁殖，数目不增加，但细胞生理活性很活跃，菌体体积增长很快，而在其后期只有个别菌体繁殖，故称这阶段为缓慢期。经过一段缓慢期后，细菌分裂速度迅速增加，进入对数期。在稳定期中，菌体生长繁殖速度逐渐下降，同时菌体死亡数目逐渐上升，最后达到新增殖的细菌数与死亡数基本相等。稳定期的活菌数保持相对平衡并处于最大值。稳定期的出现是由于食料的减少和有毒代谢产物的积累。在衰老期，细菌死亡速度大大增加，超过其繁殖速度，只有少数菌体进行繁殖，进行内源呼吸，所以活细菌曲线显著下降。在对数期，微生物的增长过程一般可用下式表示：式中X――某一时间t时微生物的重量或浓度K1――微生物增长率积分，得：式中X0一－微生物的起始重量或浓度。对于废水生物处理中的活性污泥来说，微生物的重量或浓度可以租略地用挥发性污泥的重量或浓度来表示，而K1则表示挥发性污泥的增长率(在实际工作中也可用污泥总量代表挥发性污泥)。在对数期，对于纯培养的细菌来说有一个很重要的概念——世代时间，或称倍增时间。它指的是细菌繁殖一代即个体数目增加一倍的时间。对数期的细菌细胞代谢活性最强，组成新细胞物质最快，细菌数目呈几何级数增加，代时稳定。因此世代时间的测定必须以对数期的生长细胞作为最佳和最快生长的对象。其测定计算如下：设时间t0时细菌浓度为X0，到时间t时细菌浓度为X，其间细菌共繁殖分裂了n代，则：式中G——世代时间。细菌的浓度xo、x可通过生长测定方法得到，时间fo、f是确定的，这样就可以测定计算得出细菌的世代时间一般来说，细菌生长繁殖极快。多数种20～30min繁殖一代，最快的世代时间仅9．8min，有的则长达几十小时。好氧细菌比厌氧细菌的世代时间短，单细胞比多细胞微生物的世代时间短，原核比真核微生物的世代时间短。同一种细菌，世代时间受培养基组成和培养条件的影响，如培养温度、pH、营养物浓度和性质等等。但是，在一定条件下，各种细菌的世代时间是一定的。在生长率下降阶段，食料或有机物浓度较低，其量已大大影响微生物的生活。科学实验表明，有机物的去除率与存在的有机物浓度成正比：式中S一—某一时间t时的有机物(基质)浓度K2一一常数积分，得：式中S0――有机物的起始浓度在内源代谢阶段，微生物的增长过程则可用下式表示：式中X—一某一时间t时微生物的重量或浓度K3——微生物自身氧化速度常数积分，得：式中Xo——微生物的起始重量或浓度缓慢期的出现是为了调整代谢。当细胞接种到新的环境后，需要重新合成必需的酶、辅酶或某些中间代谢产物以适应新的环境。在水处理中为了避免缓慢期的出现，可考虑采用处于对数生长期或代谢速率旺盛的污泥进行接种。另外增加接种量及采用同类型反应器的污泥接种也可达到缩短缓慢期的效果。在废水生物处理过程中，如果维持微生物在生长率上升阶段(对数期)生长，则此时微生物繁殖很快，活力很强，处理废水的能力必然较高；但必须看到，此时的处理效果并不一定最好，因为微生物活力强大就不易凝聚和沉淀，并且要使微生物生长在对数期．则需有充分的食料，就是说，废水中的有机物必须有较高的浓度。在这种情形下。相对地说，处理过的废水所含有机构浓度就要比较高些，所以利用此阶段进行废水的生物处理实际上难于得到较好的出水。稳定期的细菌生长速率下降，细胞内开始积累贮藏物和异染颗粒、肝糖等，芽孢细菌也在此阶段形成芽孢，若产生抗生素的放线菌也在此时期大量形成。处于稳定期的污泥代谢活性和絮凝沉降性能均较好，传统活性污泥法普遍运行在这一范围。衰老期阶段只出现在某些持殊的水处理场合，如延时曝气及污泥消化。图3—3示微生物的代谢速率与食料和微生物重量或浓度之比(食料／微生物)的关系。在活性污泥法的推流式曝气池进口附近，食料与微生