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抗CD47抗体联合阿糖胞苷靶向治_省略_SCID小鼠单核细胞白血病的研究_王颖超第15卷第7期2013年7月中国当代儿科杂志ChinJContempPediatrVol．15No．7Jul．2013DOI：10．7499/j．issn．1008－8830．2013．07．017论著·实验研究抗CD47抗体联合阿糖胞苷靶向治疗NOD/SCID小鼠单核细胞白血病的研究王颖超冯磊殷楚云马丽娜魏永纬王春美盛光耀(郑州大学第一附属医院儿科，河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南郑州450052)［摘略。方法要］目的探讨CD47在急性髓细胞白血病NOD/SCID小鼠模型中的预后意义及靶向治疗的最佳策+－将分选的CD34CD38白血病干细胞（leukemiastemcells，LSCs）移植入NOD/SCID小鼠体内，建立小鼠急性单核细胞白血病模型；抗人CD47单克隆抗体单独或联合阿糖胞苷治疗白血病小鼠7～14d，并进行疗效分析。将LSCs与小鼠巨噬细胞在含抗CD47单克隆抗体的培养液中共培养，观察CD47对巨噬细胞吞噬LSCs能力的影响。结果+－THP-1细胞中存在CD34+CD38－LSCs，比例约为0．12%±0．06%，将分选后的CD34CD38LSCs（比例高达97．0%±1．7%）移植入NOD/SCID小鼠后成功建立白血病模型。体内实验表明，阿糖胞苷（7d）联合抗++CD47单克隆抗体（14d）治疗后，白血病小鼠外周血和骨髓中CD33CD45白血病细胞下降最明显（P＜0．01），生抗CD47单克隆抗体组吞噬指数（76．9%±12．2%）明显高于抗存时间明显长于其它各组。体外共培养2h后，CD45单克隆抗体组（7．60%±2．4%，P＜0．01）。结论要临床意义。［关键CD47高表达是急性髓细胞白血病的预后不良因素。阿糖［2013，15（7）：577－582］中国当代儿科杂志，词］急性髓细胞白血病；白血病干细胞；CD47；阿糖胞苷；靶向治疗；小鼠胞苷联合抗CD47单克隆抗体可有效杀灭普通白血病细胞和白血病干细胞，对彻底治愈急性髓细胞白血病具有重EffectivenessofAnti-CD47antibodyandAra-CcombinationtargetingtherapyNOD/SCIDmouseofmyeloidleukemiaWANGYing-Chao，FENGLei，YINChu-Yun，MALi-Na，WEIYong-Wei，WANGChun-Mei，SHENGGuang-Yao．Depart-mentofPediatrics，FirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China（Email：yingchaowang152@163．com）Abstract：ObjectiveTostudytheprognosticsignificanceofCD47inaNOD/SCIDmousemodelofacutemyeloidleukemia（AML）andthebeststrategyfortargetedtherapyforthisdisease．MethodsCD34+CD38－leukemiastemcells（LSCs）wereseparatedandtransplantedintoNOD/SCIDmicetoestablishamousemodelofacutemonocyticleukemia（AMoL）．Anti-humanCD47antibody，aloneorcombinedwithcytosinearabinoside（Ara-C），wasusedtotreatthemicewithAMoLfor7－14days，andtherapeuticefficacywasassessed．LSCswereculturedtogetherwithmousemacrophagesinculturemediumcontaininganti-CD47oranti-CD45monoclonalantibodyfor2hours，toobservethephagocyticabilityof+macrophagestoLSCs．ResultsCD34CD38－LSCsexistedamongTHP-1cells，withacontentofabout（0．12±0．06）%，andamousemodelofAMLwassuccessfullyestablishedafterthepurifiedCD34+CD38－LSCs（97．0%±1．7%）weretransplantedintoNOD/SCIDmice．TheinvivoexperimentshowedthatmicewithAMoLhadthemostsignificantdecreaseinCD33+CD45+leukemiacellsinperipheralbloodandbonemarrowandsurvivedthelongestafterbeingtreatedwithAra-C（7days）plusanti-CD47monoclonalantibody（14days）（P＜0．01）．After2hoursofinvitroculture，thephagocyticindexintheculturemediumcontaininganti-CD47monoclonalantibodywassignificantlyhigherthanintheculturemediumcontaininganti-CD45monoclonalantibody（76．9%±12．2%vs7．60%±2．4%；P＜0．05）．ConclusionsHighexpressionofCD47isanadverseprognosticfactorinAML．Combinationtherapywithanti-CD47monoclonalantibodyandAra-CcaneffectivelyeliminateleukemiacellsandLSCs，demonstratinggreatclinicalsignificanceincuringAML．［ChinJContempPediatr，2013，15（7）：577－582］Keywords：Acutemyeloidleukemia；Leukemiastemcell；CD47；Cytosinearabinoside；Targetedtherapy；Mice急性髓细胞白血病（acutemyelocyticleukemia，AML）占儿童急性白血病的15%～20%，除M3外，［2013－01－10；［修回日期］2013－03－08收稿日期］［作者简介］王颖超，男，博士，副教授，副主任医师。［1］其它各型都是难以治疗的儿童肿瘤性疾病之一。AML各亚型临床疗效不同，然而除M3外的总体生·577·第15卷第7期2013年7月中国当代儿科杂志ChinJContempPediatrVol．15No．7Jul．2013［2］存率在上世纪60年代低于10%。近年来，随着化疗方案的逐步改良和完善，诱导化疗结束完全缓［3］解率已达80%以上，但是5年无病生存率却只有40%～50%［4］，长期生存率依然很低，严重威胁着全1．4LSCs细胞体外吞噬功能的检测［8］参照尹美珍等所用方法分离、培养小鼠腹腔巨噬细胞。将分选的LSCs细胞与小鼠巨噬细胞共培养2h，分为CD47单克隆抗体（终浓度为7μg/mL）组、CD45单抗组、IgG1单抗组和阴性对照组（培养液中不加任何抗体）。倒置荧光显微镜观察巨噬细胞的吞噬率。吞噬率=（吞噬了LSCs的吞噬细胞/100个巨噬细胞）×100%。1．5白血病小鼠体内单克隆抗体治疗取40只荷瘤小鼠依据腹腔注射药物不同随机分为5个组，每组8只，具体药物使用情况如下：（1）生理盐水（对照）×14d；（2）抗IgG1抗体100μg×14d；（3）抗CD47抗体100μg×14d［9］；（4）Ara-CC100mg·m2×7d+抗100mg·m2×7d；（5）Ara-CD47抗体100μg×14d。开始治疗后，每日观察小鼠一般情况变化。比较不同种类治疗药物组及治疗前后各指标的变化。1．6统计学分析采用SPSS17．0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，各组间均数比较采用单因素方差分析；计数资料以率表M法进行生存示，组间比较采用卡方检验；采用K-P＜0．05为差异有统计学意义。分析，世界儿童及青少年的健康和生命，而复发和耐药始终是影响最终治疗效果的重大障碍。最新研究认AML是一种与白血病干细胞（leukemiastem为，cell，LSCs）密切相关的疾病，AML的发生、发展以及治疗中耐药和缓解后复发均与LSCs有关，常规的［5-6］。故而，化疗药物不能将LSCs完全清除阐明LSCs在AML发生、发展中的分子机制，实现基于发病机制或分子靶点的靶向疗法及协同靶向疗法，降低AML的病死率已成为当前儿科领域中的一项重要的科研课题。研究发现CD47参与调控LSCs在AML中的作用［7］，本研究旨在探索CD47在AML小鼠模型中的作用及靶向治疗效果，为彻底治愈AML寻找新的治疗策略。11．1材料与方法主要仪器与试剂流式细胞仪（Beckmancoulter公司，美国）；改良型RPMI1640培养基、优级胎牛血清（Hyclone公司，美国）；单克隆抗体（eBioscience公司，美国）；阿C，Sigma公司，糖胞苷（Ara-美国）。1．2细胞株及实验动物1细胞株购于中科人急性单核细胞白血病THP-院上海细胞库研究所，用含20%胎牛血清和1%青、5%CO2的培养箱内链霉素的完全培养基，置于37℃、6～8周龄，培养。NOD/SCID小鼠，雌雄不限，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，置于层流架带盖鼠盒中饲养，符合SPF标准。1．3THP-1细胞株LSCs（CD34+CD38－）的流式分选及白血病模型的建立61细胞，取对数生长期THP-调整密度为10个/mL，PE和抗CD38-APC单克隆抗体；实验管加入抗CD34-PE、IgG1-APC为同型对照，以IgG1-孵育染色，上机检测，确定LSCs比例后分选LSCs。40只NOD/SCID小每只接种LSCs细胞1×10个（0．2mL）。所有鼠，NOD/SCID小鼠移植前不做任何处理，对小鼠所有操作均在无菌层流室内进行。自接种后，观察小鼠一般状况，每隔一周经尾静脉取血，观察白细胞变化及成瘤情况。引颈处死频死小鼠，对肝、脾、肺、肾、脑及病变组织等行病理组织学检查，流式细胞仪检测骨髓CD33+CD45+细胞比例。522．1结果1细胞株LSCs被吞噬抗CD47单抗对THP-情况的影响1细胞株流式细胞术结果显示在白血病THP-+－中存在CD34CD38的LSCs，比例为0．12%±0．06%；细胞分选后采用流式细胞仪检测显示CD34+CD38－LSCs纯度高达97．0%±1．7%。见图1。体外共培养试验后，普通光镜下可发现抗CD47组存在多种不同吞噬状态的细胞，而抗CD453组间吞噬指数或IgG1单抗组未见明显吞噬现象，差异有统计学意义（P＜0．01）。见表1。表11细胞株LSCs的吞噬率小鼠腹腔巨噬细胞对人THP-（±s，%）抗体类型阴性对照抗IgG1抗CD45抗CD47F值P值吞噬率3．0±1．32．8±1．27．6±2．476．9±12．2a332．162＜0．001a：与阴性对照组、P＜0．01抗IgG1组和抗CD45组相比，·578·第15卷第7期2013年7月中国当代儿科杂志ChinJContempPediatrVol．15No．7Jul．2013104F1F2104F1F2103CD34-PECD34-PE103102102101F3F4101F3F410010101