替沙坦对2型糖尿病大鼠心功能的影响

替沙坦对2型糖尿病大鼠心功能的影响王小华，殷士良，赵玉萍，刘晓峰，赵春艳，周凤娟河北省唐山市滦县人民医院内分泌科河北滦县063700[摘要]目的观察替米沙坦对2型糖尿病大鼠心功能的保护作用，探讨其可能的细胞因子机制。方法40只雄性SD大鼠随机分为3组：正常对照组(C组)10只，糖尿病模型组(D组)，替米沙坦组(T组)。给予替米沙坦12周末结束实验，检测心功能，免疫组织化学方法检测心肌组织中TGF-β1和HGF蛋白含量。结果与C组比较，D组，T组LVEDP显著升高(P＜0.01)，-dp/dtmax降低(P＜0.05)；与D组比较，T组LVEDP显著降低，(P＜0.01)，-dp/dtmax升高(P＜0.05)。与C组比较，D组，T组TGF-β1和HGF灰度值降低，与D组比较，T组TGF-β1灰度值升高(P＜0.01)；T组HGF灰度值降低(P＜0.01)。结论替米沙坦能够改善糖尿病大鼠心功能，可能与降低心肌中TGF-β1，升高HGF表达有关。关键词2型糖尿病；心功能；TGF-β1；HGF；替米沙坦EffectsoftelmisartanoncardiacfunctionindiabeticratsWangxiaohua,Yinshiliang,Zhaoyuping,Liuxiaofeng,Zhaochunyan,ZhoufengjuanDept.ofEndocrinology,PeopleHospital,LuanCounty，TangshanCity,HebeiProvince,Luanxian063700,ChinaAbstractObjectiveThroughinvestigatingtheprotectiontomyocarditionoftelmisartanindiabeticrats,explorecytokinemechanismwhichtelmisartanimprovediabeticmyocardium.MethodFortymaleSDratswererandomlydividedintothreegroups:thenormalcontrolgroup(Cgroup),diabetescontrolgroup(Dgroup),telmisartaninterventiongroup(Tgroup).Theexperimentendeduntill2weeksgiventelmisartan.HeartfunctionweremeasuredandsemiquantitativeexpressionsofTGF-β1andHGFproteinweredeterminedbyimmunohistochemistricmethod.ResultsLVEDPofDandTgroupsweremuchhigher(P0.01)and-dp/dtmaxweredeclinedsignificantlycomparedwihtCgroup(P0.05).LVEDPofTwasdeclinedsignificantly(P0.01)and-dp/dtmaxwaselevatedstatisicallysignificantcomparedwihtDgroup(P0.05).ThelevelsofHGFandTGF-β1ofDandTgroupswereevatedstatisicallysignificantcomparedwihtCgroup(P0.01),ThelevelsofHGFof王小华，女，河北省唐山市滦县人民医院，硕士。通讯地址：河北省唐山市滦县人民医院内分泌科，063700，联系电话:[phone]，E-mail:[e-mail]ically(P0.01),howervethelevelsofTGF-β1ofTgroupwasdeclinedstatisicallycomparedwihtDgroup(P0.01).ConclutionTelmisartancanimprovethecardiacfunctionofdiabeticratsanditsprotectiveeffectmayberelatedtothereductionofTGF-β1andincreationofHGF.Keywords：Type2diabetesmellitus；Cardiacfunction；Transforminggrowthfactor-β1;Hepatocytegrowthfactor;Telmisartan糖尿病心肌病早期表现为舒张功能障碍，转化生长因子β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)和肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)为一对拮抗因子，共同参与心肌纤维化与心室重塑。替米沙坦是一种新型的AT1拮抗剂，对糖尿病心肌起保护作用。通过建立2型糖尿病大鼠模型，并用替米沙坦对其进行干预，探讨替米沙坦对糖尿病心肌保护作用的细胞因子机制。材料和方法1材料1.1实验动物体重（180±20）g，批号：SCXK（辽）2003-0007。1.2试剂链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司产品，批号013K0962)。TGF-β1和HGF兔抗大鼠多克隆抗体、Ⅱ抗山羊抗兔试剂盒(均由武汉博士德试剂公司提供)。2方法2.1DM实验模型的复制40只SD大鼠随机分为正常对照组(C组)10只，糖尿病模型组（D组）15只，替米沙坦组(T组)15只。后两组高糖高脂饲料喂养4周后，给予链脲佐菌素（STZ）30mg／kg尾静脉一次性注射，l周末测非禁食血糖≥16.7mmoI／L为2型糖尿病大鼠。C组给予常规饲料喂养4周后以等体积的枸橼酸盐注射。T组大鼠给予替米沙坦8.34mg／kg/d(相当于人80mg/d)灌胃。C组，D组给予等体积的生理盐水灌胃，各组大鼠继续原饲料喂养12周结束实验。2.2心功能测定用20％乌拉坦(0.5ml/100g，)腹腔注射麻醉后，打开胸腔,气管插管，呼吸机辅助呼吸，呼吸机参数为呼吸频率40次/分，潮气量：8ml/kg，吸呼比：1：2。用普通Cournand心导管插至左心室尖，BL-420F生物机能实验系统监测左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末期压(LVEDP)，等容收缩期左室内上升的最大速率(dp／dtmax)，等容舒张期左室内压下降的最大速率(-dp/dtmax,mmHg／s)。2.3心肌中TGF-β1和HGF水平检测2.4.1标本处理将各组大鼠，20％乌拉坦麻醉，测定心功能后，取左室同一部位室壁组织，立即用10％中性甲醛固定，备做免疫组化。组织切片经常规二甲苯，梯度酒精脱蜡，0.1MPBS缓冲液冲洗三次，每次2min；0.1M枸橼酸缓冲液(pH4.4)140℃2min进行抗原修复，自然冷却至室温，0.1MPBS缓冲液洗涤三次,每次2min；新鲜配制3%H2O2室温处理15min，灭火过氧化物酶，蒸馏水冲，0.1MPBS缓冲液洗三次，每次2min。滴加1O%正常山羊血清封闭游离的结合位点，减少非特异染色；分别滴加一抗兔抗大鼠多克隆TGF-β1和HGF抗体(1:100)，4℃冰箱过夜；0．1MPBS缓冲液洗3次，每次2min；滴加生物素标记的二抗IgG山羊抗兔工作液，37℃孵育3Omin；0．1MPBS缓冲液洗涤3次，每次2min；加SABC,37℃孵育30min；0．1MPBS缓冲液洗涤3次，每次2min;DAB显色，苏木素轻度复染，脱水透明，封片。阴性对照用PBS替代一抗。2.4.2结果判定心肌细胞弱或点状着色为弱阳性，心肌细胞中等强度或较大范围着色阳性，心肌细胞较强或较大范围着色为强阳性。灰度分析采用CIAS-1000细胞图像分析仪(北京大恒图象视觉有限公司)进行TGF-βl和HGF灰度分析，每个标本随机连续切取5张切片，观察每张左上，左下，右上，右下，中央五个400倍显微镜视野图象，计算平均灰度值作为TGF-β1及HGF蛋白的半定量表达(每张切片的平均灰度值减去这张切片背景的平均灰度值为该张切片的实际灰度值，灰度值越低，蛋白表达量越高)。3统计学软件采用SPSS13.0软件进行分析。所有数据以均数±标准差(_x±s)表示,多组间采用单因素方差分析One-wayAnova，两两比较用t检验，P﹤0.05认为有差异。结果1试验结束时各组大鼠心功能测定(见表1)与正常对照组相比，各组LVSP（127.63±4.74，132.51±7.87与134.56±8.38，P＞0.05）和＋dp/dtmax无统计学差异（4955.61±178.93，5021.38±99.99与5095.20±162.51，P＞0.05）。与正常对照组相比，糖尿病模型组及替米沙坦组LVEDP升高（5.57±0.32，4.40±0.42与3.05±0.40，P0.01）,-dp/dtmax降低（4887.69±92.12，5058.76±125.03与5297.47±145.25，P0.05）。与糖尿病模型组相比，替米沙坦组LVEDP降低（4.51±0.23与5.57±0.32，P0.01），-dp/dtmax升高（5058.76±125.03与4887.69±92.12，P0.05）。表1各组大鼠心功能比较(x±s)组别LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)C组(n=9)134.56±8.383.05±0.405095.20±162.515297.47±145.25D组(n=7)127.63±4.745.57±0.32a4955.61±178.934887.69±92.12aT组(n=8)132.51±7.874.40±0.42a,b5021.38±99.995058.76±125.03a,c注：C组：正常对照组；D组：糖尿病模型组；T组：替米沙坦干预组；与C组相比，aP＜0.01，与D组相比，bP＜0.01，cP＜0.05。2TGF-β1和HGF免疫组化检测(见表2)（1）定性表达C组大鼠心肌TGF-β1表达呈弱阳性，细胞浆或细胞膜轻度或点状染色,范围较小；D组大鼠心肌TGF-β1表达呈强阳性，心肌细胞较强或大范围着色；T组心肌TGF-β1表达呈阳性，心肌细胞中等强度或中等范围着色；C组大鼠心肌HGF表达呈弱阳性，细胞浆可见点状染色；D组HGF表达呈阳性，心肌细胞中等强度或中等范围着色；T组HGF表达表达呈强阳性，心肌细胞较强或大范围着色。(2)心肌中TGF-β1和HGF半定量表达与C组比较，D，T组TGF-β1和HGF灰度值显著降低；与D组比较，T组TGF-β1灰度值显著升高，HGF灰度值显著降低。表2心肌细胞内TGF-β1及HGF的灰度值比较(x±s)组别TGF-β1HGFC组(n=9)79.00±2.1878.78±1.72D组(n=7)47.86±1.35a63.86±3.13aT组(n=8)65.00±1.20a,b45.00±2.07a,b注：C组：正常对照组；D组：糖尿病模型组；T组：替米沙坦干预组；与C组相比，aP＜0.01；与D组相比，bP＜0.01；T1组与T2组相比，dP＜0.05。讨论糖尿病心肌病变是糖尿病的早期并发症之一，最早表现为心脏舒张功能的改变。实验中发现与正常对照组相比，糖尿病模型组LVEDP升高，-dp/dtmax降低，而LVSP和+dp/dtmax无差异，可以看出糖尿病模型组存在舒张功能损害，经替米沙坦干预12周后舒张功能得到明显改善，LVEDP降低，-dp/dtmax升高。TGF-β1和HGF作为一对拮抗因子,在多种器官的纤维化中起作用[1，2]。高血糖可通过激活蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)途径直接刺激TGF-β1的表达，进而促进成纤维细胞增生、肥大及胶原合成增加。降低TGF-β1可延