报告基因和荧光淬灭.

报告基因技术和荧光淬灭技术2008年诺贝尔化学奖由三位科学家下村脩(OsamuShimomura)、MartinChalfie和钱永健(RogerTsien)三人分享。1962年，下村修和约翰森从维多利亚多管水母（Aequoreavictoria）中分离生物发光蛋白-水母素（aequorin）时，意外地得到了一个副产物。它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年，他们得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白（GFP）。GFP在水母中之所以能发光，是因为水母素和GFP之间发生了能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。直到1992年，道格拉斯•普瑞舍克隆并测序了野生型的GFP，文章发表在《Gene》杂志上。但具有讽刺意味的是，基金评审委员会认为普瑞舍的工作没有意义，不愿提供经费。普瑞舍一气之下，离开了科学界，将GFP的cDNA送给了几个实验室。GFP的结构以及发光原理，要到1990年代通过X光衍射才得到证实：GFP的肽链构成一个桶状结构，在其中心由3个氨基酸携带的芳香集团构成了发光核心结构。但克隆并在真核细胞表达很长时间没成功随后哥伦比亚大学的MartinChalfie就考虑只用它的编码区域来表达。他用PCR的方法扩增了GFP的编码区，将它克隆到表达载体中，通过UV或蓝光激发，在大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。这才是GFP作为荧光指示剂的真正突破，文章发表在《Science》杂志上。证明从水母上分离出来的GFP基因可以在其它物种上表达，正确地折叠，发出荧光。这些研究成果为GFP在生物学研究上的使用，奠定了基础。钱永健的贡献，是利用他在活体荧光研究方面的丰富经验，对GFP进行改造，他的实验室利用定点突变改造出来EGFP，不仅提高了荧光强度，更重要的可以在普通的荧光显微镜下用现有的荧光滤镜观察到，而且光谱单一，不会和其它荧光染料的光谱发生干扰。接着他的实验室又陆续推出了不同颜色的GFP，如蓝色(BFP)和黃色(YFP)的荧光蛋白。这为同时在同一个细胞或组织内标记多种蛋白或结构打下了基础用途：1、构建融合表达质粒N端、C端定位，形成融合蛋白，观察细胞内蛋白质分子动态变化(pEGFP-C1,pEGFP-N1,Clontech)2、转基因研究，筛选转化细胞，追踪外源基因3、判断蛋白质分子的相互作用和距离（FRET）检测方法：紫外灯荧光显微镜激光共聚焦显微镜荧光激活的细胞分拣器（FACS）共定位GFP：greenfluorescenceprotein多管水母科：Aequorleidae27-30kD,395nM海紫罗兰科：Renillidae54kD,498nMFRET，即荧光能量共振转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,)随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。原理：荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。FRET，荧光能量共振转移GFP由11个β片层组成桶状构成疏水中心，由α螺旋包含着的发光基团位于其中。这个发光基团(chromophore)是由3个氨基酸（Ser65、Tyr66、Gly67）经过环化、氧化后形成的咪唑环，在钙离子激发下产生绿色荧光。野生型GFP吸收紫外光和蓝光，发射绿光。通过更换GFP生色团氨基酸、插入内含子、改变碱基组成等基因工程操作，实现对GFP的改造，如增强其荧光强度和热稳定性、促进生色团的折叠、改善荧光特性等。GFP近年来发展出了多种突变体，通过引入各种点突变使发光基团的激发光谱和发射光谱均发生变化而发出不同颜色的荧光，有BFP，YFP，CFP等。这些突变体使GFP应用于FRET成为可能,为FRET技术用于活体检测蛋白质相互作用提供了良好的支持。FRET青色荧光蛋白（cyanfluorescentprotein,CFP）、黄色荧光蛋白（yellowfluorescentprotein,YFP）为目前蛋白-蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET对。CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱相重叠。将供体蛋白CFG和受体蛋白YFG分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋白之间的距离在5-10nm的范围内，则供体CFP发出的荧光可被YFP吸收，并激发YFP发出黄色荧光，此时通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少。如Tsien&Miyawaki采用FRET技术检测细胞内Ca2+的浓度变化。他们将CFP和YFP分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一个细胞内。当细胞内具有高的Ca2+浓度时，钙调蛋白和钙调蛋白结合肽结合，可诱发FRET，使受体蛋白YFP发出黄色荧光，因此细胞呈黄色。当细胞内Ca2+浓度低时，FRET几乎不发生，因此检测时CFP被激发，发出绿色荧光，细胞呈绿色。FRET敏排放-双通道成像使用一种算法，纠正串扰激发和发射受体漂白-也被称为施主去猝灭受体光漂白时，这种技术措施增加了供体发射荧光寿命成像显微镜（FLIM）-荧光蛋白（或其他荧光）体寿命测量的变化光谱成像-令人兴奋的一个或两个波长，测量供体和受体的完整光谱剖面荧光偏振成像-测量偏振平行和垂直于激发高信号噪声FRET技术在细胞生物学应用每个FRET以上列出的方法都有长处和短处。例如，一方面，两个通道成像法是最简单，但需要最复杂的控件集。另一方面，FLIM的可以得到明确的测量FRET效率，但是昂贵。优缺点PrincipleoftheassayRyoichiAraietal.ProteinEng.2000;13:369-376荧光蛋白对选择荧光素酶，Luciferase是指生物体内能催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称按来源分类：萤火虫荧光素酶（FL）60-64kD细菌荧光素酶（BL）77-79kD按性质分类：FL蛋白质和脂类复合物BL、两个多肽亚基组成的单加氧酶荧光素酶报告基因方法发光机理：BL以脂肪醛（RCHO）为底物，在还原型黄素单核苷酸（FMNH2）及氧脂肪醛氧化成脂肪酸+光子（490n荧光）FL在Mg2+、ATP、O2参与下，催化D-荧光素（D-Luciferin),产生激活态荧光素+光子（550-580nM)荧光检测方法：荧光素酶检测（luminometer)萤火虫(Photinuspyralis)萤光素酶和海肾(Renillareniformis)萤光素酶可在单个样品中连续测量。测量过程是：加入萤光素酶检测试剂II(LARII)产生萤火虫萤光信号，信号持续至少1分钟，这样先测量萤火虫萤光素酶报告基因。定量萤火虫萤光强度之后，再在同一样品中加入Stop&Glo®试剂，将上述反应猝灭，并同时启动海肾萤光素酶反应，同时进行第二次测量。如果使用带有试剂自动注射器的萤光发光计，两个检测可在4秒内完成。在DLRTM检测系统中，两个报告基因产生的线性检测范围均在小于10-18摩尔的灵敏度范围内，两个报告基因在实验宿主细胞内均无内源活性。另外，此系统中一体化形式的双萤光素酶检测既可快速定量检测转染细胞，也可用于快速定量检测无细胞转录/翻译反应体系中的两个报告基因。1、启动子活性检测2、ATP浓度3、环境食品中的有害物质用途Distal100kbProximalApprox.1kbPromoterTranscriptionUnitCodinganduncodingsequencesfrom1kbto200kb基因启动子活性检测AUGTAAUAAAINTRONINTRONEXONEXONEXON5’untranslatedSegmentofmRNAcopyTranscriptionunitCodingsequence3’untranslatedSegmentofmRNAcopy3’endOfprocessedmRNAcopyStartpointinitiatorcodonterminatorcodonterminationsiteForforproteinforproteinsynthesisfortranscriptionTranscriptionsynthesis(UGA,UAA,orUAG)signalforsiteof3’endtrimmingandpoly(A)tailadditionTranscriptionlevelsReporterRead-outPromoterofgenexReportergeneCooperativityintheserumalbumingeneSerumalbumingenePolIITFIIDAPFACFC/EBPNF-1Transcriptionlevels用于荧光素酶报告基因技术的载体pGL3-Basic:用来研究外源启动子序列的活性.用于荧光素酶报告基因技术的载体pGL3-Promoter：研究enhencer或者3‘UTR的转录激活活性用于荧光素酶报告基因技术的载体pGL3-Control用于荧光素酶报告基因技术的载体pGL3-EnhancerVector：用来验证功能启动子元件的存在及活性DualluciferaseassayofSAD-A5′-UTRactivity荧光淬灭实验是指导致特定物质的荧光强度和寿命减少的所有现象荧光猝灭分为静态猝灭和动态猝灭。基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物，且该复合物使荧光完全猝灭的现象称为静态猝灭。激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭由于荧光的再吸收、荧光物质发生化学变化而观察不到荧光的现象一般不称为荧光猝灭利用某种物质对某一种荧光物质的荧光猝灭作用而建立的对该猝灭剂的荧光测定方法，即为荧光猝灭法荧光猝灭法比直接荧光测定法更为灵敏，具有更高的选择性肿瘤转移过程应用举例：MMP-2荧光分析药物筛选原理图加入底物Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2，在37C温育过程中，MMP-2水解底物，释放出Mca发光基团和Dpa淬灭基团。此时可以检测到荧光，随着时间延长，两种基团浓度增加，基团之间相互碰撞机率增大，导致发光基团荧光逐渐被淬灭。表1.4BM205C4对MMP-2活性抑制作用浓度荧光值酶活性抑制率（nmol/L）（ABUs/min）（%）0.02.570.04—5.01.790.0830.310.01.740.1632.325.01.250.1151.250.00.710.0872.3100.00.140.0194.7多肽对MMP-2酶活性抑制作用多肽对MMP-2酶活性抑制作用重组人MMP-2分别与不同浓度的多肽M204C4（图A）M205C4（图B）在37C温育45min后，加入底物，立即在波长Ex/Em=328/393测定荧光，每min1次，共10次，计算最大反应速率，同时与对照进行比较，所得百分率即为相对酶活性。实验重复3次，所得数据以SD表示。多肽对MMP-2酶活性抑制作用状态栏谢谢！