报告基因检测

荧光素酶报告基因原理：转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferaseassay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。其原理简述如下：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。（2）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。步骤：1、(1)铺细胞于24孔板中，{选用48孔板（如果比较难做的系统可以选用24孔板甚至12孔板，细胞量越多表达的酶相应越多），铺板密度约为30%（如果比较着急做实验，密度可以提高）。}每孔细胞数为20万细胞左右，待细胞融汇度达到70%（适合磷酸钙转染）、85%（适合脂质体转染）时进行转染。一般选用细胞密度为50-70%时进行转染（因为转染后要让质粒表达一定的时间，一般是18-24小时，故而这个细胞密度到加药时密度会差不多到100%）。转染体系的配置：目标蛋白的质粒（pBind-），luc质粒，fermentas转染试剂，（质粒：转染试剂=1：1-3（μg：μL）这个比例根据细胞、质粒转染难易程度而定，必要时需要自己摸条件）。——此步骤与与普通的细胞转染实验的要求相同。脂质体法（1）在细胞密度达到80%左右，于转染前1小时用基本培养基（常用无血清培养基Opti-MEM）为细胞换液。【对转染后易死的细胞可用不含双抗但含有10%FBS的DMEM或1640培养基】（2）根据细胞培养皿的大小，按下表配制转染试剂体系。将适量欲转染的质粒DNA与适量体积的Opti-MEM混匀。同时，将适量的脂质体【采用下表中所给量的一半】也和适量的Opti-MEM混合。室温静置5分钟【时间过长会降低脂质体活性】。（3）将（2）中两溶液转移到同一EP管中，吹打使其混匀。静置20分钟。（4）将质粒DNA和脂质体混合液加入到细胞培养皿中，置于CO2培养箱中37℃培养（5%CO2，37℃）4－6小时后更换正常培养基（含双抗和10%FBS）。脂质体法各试剂用量DNA(ug)opti培养基（μl）脂质体（μl）opti培养基（μl）96well0.2200.52024well0.8502.05012well1.61004.01003.5cm4.025010.02506cm8.050020.050010cm24150060.015002在转染合适的时间点，换成含血清（10%FBS）基本培养基培养24小时左右，再根据实验需要处理细胞。3加Reporterlysisbuffer裂解细胞之前弃去培养液，500μl预冷的PBS清洗细胞两次，吸尽PBS。——荧光酶的酶促反应会被痕量的钙所抑制，故用磷酸钙转染的细胞在收集细胞前应充分洗涤除去含钙介质。4每孔中加入120μl1×Reporterlysisbuffer。室温放置2-5分钟裂解细胞，将24孔板放在-80℃冰箱，待测定时，室温放置，将其融化。——-80℃到室温的单次冻融有助于细胞裂解。5利用Luciferaseassaykit试剂盒测定荧光素酶的活性：取20μl细胞裂解上清液，加入荧光素酶底物50μl，迅速混匀，测定荧光素酶的活性。—一个样品做三个平行实验，在上清液与荧光素酶底物迅速、充分混匀的同时保证每份样品加入酶标板的时间间隔一致。裂解—加荧光素酶试剂1）5XlysisinddH2o，稀释到1X。60ulX51(48孔板)=3060ulddH2o2448ullysis5X612ul每孔60ul裂解细胞，于-80°C10min,4°C10min,反复冻融易于裂解。2）fireflyluciferasesubstrate50ulX51=2550ulluciferase1X2290ulLuci(棕色管)10X255ulATP500X5ul每个孔加50ulluciferase于双报告基因仪器检测。3）Renillasubstrate50ulX50=stopbuffer(CTZbuffer)1X2225ulstop（透明管）10X250ulslip(棕色管)100X25ul再加50ulrelina于双报告基因仪器检测6β-半乳糖苷酶活性的测定：取10μl细胞裂解液，加入120μl下面混合的试剂：3μl100×Mg（0.1MMgCl2）、66μlONPG（溶于0.1M磷酸钠溶液中，4mg/ml）、200μl0.1M磷酸钠缓冲液（混合41ml0.2MNa2HPO4·H2O，9ml0.2MNaH2PO4·2H2O，50mlH2O配制而成），在37℃温育30分钟左右，至液体颜色变黄。最后加入50μlNa2CO2终止反应，测定OD420。(7)荧光素酶的活性和β-半乳糖苷酶活性的比值即为报告基因的数值。3.2仪器安装3.2.1双击Veritas图标运行软件；3.2.2从WelcometoVeritas对话框中点击RunPromegaProtocol；3.2.3浏览DLR文件夹，选择合适的检测程序，例如DLR检测中使用的是单注射器那就选择DLRwithoneinjection.；3.2.4点击Options选择需要检测的孔，默认值是预置了Promega操作方案的最佳测量值。但也可以根据自己需要在OtherOptions面板中进行检测时间，延迟时间和加样体积的调整。修改结束，点击ApplyChanges确认修改，或者点击SaveProtocolAs保存修改方案。另外也可以点击Options返回MainDialogBox；3.2.5在MainDialogBox.中输入个人信息，例如Experiment,Operator,PlateNo.,andNotes。3.3样品分析3.3.1准备含有裂解细胞培养物的96孔板；注：为了保证数据良好的重现性。加入试剂前，室温下平衡细胞培养基；3.3.2准备注射器。将注射器1进样口放入LARII，将注射器2进样口放入Stop&Glo®试剂瓶，在MainDialogBox上用Prime键对注射器进行初始化；注：不能混用注射器。Stop&Glo®试剂对萤火虫荧光素酶活性有猝灭作用。建议一个注射器专门吸入Stop&Glo®，另一个专门吸入LARII；3.3.3样品板放入Veritas™微孔板发光检测仪中，点击“Start”开始检测。检测结束后，所有需要检测的样品检测结果会以Excel表格形式显示，如检测中遇到其他问题，请参考问题导读获取更多信息；3.3.4检测结束就可以通过Excel进行数据分析；3.3.5检测结束取出检测板。选择ReversePurge将管路中剩余试剂回收到试剂瓶，而后彻底清洗注射器。