木糖醇生产的研究进展

木糖醇生产的研究进展摘要：介绍了木糖醇合成的国内外研究现状，分析了各种工艺的优缺点，同时着重介绍了生物法转化葡萄糖生产木糖醇的概况及各自特点；对生物法转化葡萄糖制备木糖醇的发展提出了见解。关键词：木糖醇，生物转化，葡萄糖AdvancesinproductionofxylitolAbstract:Thepresentreviewdescribedtheproductionofxylitolbydifferentprocessesandtheadvantagesanddisadvantagesofeachprocess,withtheemphasisontheproductionbymicrobiologicalconversionfromglucose,andsuggestionforthedevelopingtrendofxylitolproductionfromglucosewereputforward.Keywords:xylitol;biologicalconversion;glucose木糖醇是一种五碳糖醇，分子式为C5H12O5，是一种无味的白色结晶粉末，外表与蔗糖相似，甜度与蔗糖相近，热量与葡萄糖相当，极易溶于水，微溶于乙醇和甲醇[1]。木糖醇在人体中代谢不需要胰岛素，可供糖尿病患者食用而不增加血糖值，木糖醇还可预防龋齿，其在医药和食品领域中应用广泛，用量较大[2]。此外，木糖醇广泛应用于造纸工业、化学工业、塑料工业、油漆涂料工业、表面活性剂工业、皮革工业、蓄电池工业等行业，2004年8月，美国能源部可再生资源办公室将其列为十二种优先开发利用的平台化合物之一[3]。近年来随着人们对木糖醇需求的不断增长，有关木糖醇的生产方法及应用研究已引起人们的广泛关注。木糖醇的合成方法包括化学合成法、化学生物合成法和全生物合成法。1化学合成法目前，国内外木糖醇工业化生产方法主要为化学合成法，即用富含多缩戊糖的玉米芯、棉子壳、甘蔗渣、桦木片等农林和工业废料经酸（如HCl，H2SO4）水解成木糖后经纯化处理和加氢反应制得木糖醇，反应式如下：C5H8O4nH2OC5H10O5nn+酸多缩戊糖水木糖C5H10O5+H2C5H12O5木糖氢气木糖醇镍化学合成法中木糖纯化工艺繁杂、酸碱消耗大；加氢过程需高温(115~135°C)、高压(约6.5×106Pa)、易燃易爆的高压氢气及对木糖溶液纯度要求很高的镍催化剂，基本建设投资及操作费用高，污染较严重[4]。化学法每生产1吨木糖醇要消耗玉米芯近10吨，耗酸3吨，耗碱2吨，活性炭120~150公斤，蒸汽30~50吨，水100M3以上[5]。针对化学合成法生产木糖醇工艺中要求高温、高压、昂贵的催化剂和繁杂的分离、净化工序的问题，国际上从上世纪70年代开始研究木糖醇生产的新途径——化学生物合成法。2化学生物合成法化学生物合成法的基本原理是将含多缩戊糖的农业废弃物(如稻草、蔗渣、玉米芯等)经稀酸水解后获得的木糖水解液，利用微生物将水解液中的木糖直接转化为木糖醇。此法可省去结晶纯化木糖的步骤，与化学合成法相比，大幅降低了水、能源和木糖的消耗，从而降低了生产成本。目前，发现并可以利用的微生物有细菌、霉菌和酵母。只有少量的细菌能发酵木糖产木糖醇，如Enterobacterliquaefaciens[6]，Myobacteriumsmegmatis[7]，Corymebacteriumsp.[8]等种属。Izumori等人发现，M.smegmatis转化木糖产木糖醇的能力较强，转化率可达40%[7]。霉菌中能转化木糖生成木糖醇的菌主要有青霉、曲霉、根霉、胶杆菌、漆斑红菌等[9]，但这些菌转化能力普遍较差。酵母转化木糖产木糖醇的能力最强，主要有Candidaspiecies[10]，Pachysolentannophilus[11]，Debarcomyceshansenii[12]，Pichiaguilliennondii[13]等种属。如C.guilliennondii[14]和C.tropicalis[15]在24小时内可转化90%以上的木糖产木糖醇。化学生物法制备木糖醇的影响因素主要有通气量、木糖浓度、发酵方式、pH值和温度等。氧气是酵母发酵木糖产木糖醇的一个重要影响因素，目前普遍采用两阶段控制溶氧法，如Nolleu等利用此法培养C.guilliennondii转化木糖产木糖醇，转化率可达80%[16]。木糖浓度是影响木糖醇产量的重要因素，提高木糖浓度可以提高木糖醇生产速率，如将木糖初始浓度从100g/L增加到150g/L，C.tropicalis在较高的通气量条件下，木糖醇生成速率可从1.78g/(Lh)提高到2.44g/(Lh)[17]。发酵方式对木糖醇产量和生产速率影响较大，半连续培养的最大生产速率大大高于间歇培养和流加培养，这是由于采用半连续培养使细胞进一步适应了木糖水解液，从而提高了生产速率[18]。pH值和温度是影响木糖醇发酵过程中关键酶木糖还原酶和木糖醇脱氢酶活力的重要因素，最适pH值和温度因不同菌株而不同。如C.guilliennondii在pH4.0到pH6.0时木糖还原酶活力最高，而木糖醇脱氢酶活力随着pH和温度的上升而升高，在pH6.5和35°C时活力达到最高[15]。化学生物合成法制备木糖醇过程具有不需要纯化木糖，也不需要高压设备，易于分离纯化等优点，但是，该法并没有解决目前以玉米芯等为原料生产木糖时存在的原辅材料与动力及酸碱消耗高、污染严重等问题。此外，目前化学加氢设备与工艺已经很成熟，这种取代现实意义不大。3全生物合成法虽然以木糖为原料生产木糖醇的化学合成法工艺成熟及化学生物合成法的研究取得较大进展，但其水解制备木糖时因酸碱消耗高而带来的污染问题日益严峻。此外，由于玉米芯大量用于生产木糖醇、糠醛、食用菌和燃料乙醇，原料来源问题已经凸现，且价格一路攀升，使得木糖醇生产成本提高，从而限制了木糖醇工业的进一步发展。近年来，以来源广泛、价格低廉的淀粉或葡萄糖为原料的全生物法制备木糖醇工艺备受青睐，该工艺的成功实施必然会降低木糖醇的生产成本，改变世界现有木糖醇生产格局，减轻资源与环境的压力，对我国木糖醇工业国际竞争力的提高和可持续发展，具有深远的社会与经济意义。利用微生物发酵葡萄糖生产木糖醇一直是人们的梦想，但自然界中还没有发现能直接发酵葡萄糖生产木糖醇的微生物。3.1多菌多步转化葡萄糖生成木糖醇早在1969年，Onishi和Suzuki就报道了一种从葡萄糖出发制备木糖醇的方法，首先通过高渗酵母D.hansenii将葡萄糖转化为D-阿拉伯糖醇(D-arabitol，D-ara)，然后D-阿拉伯糖醇在Acetobactersuboxydans的作用下氧化为D-木酮糖，最后D-木酮糖在酵母C.guilliermondii作用下还原为木糖醇[17]。77.5g/L的葡萄糖经3种微生物3步发酵后可获得9.0g/L的木糖醇，历时211小时，收率11%。由于此法过程长、收率低，没有应用价值，该路线长期被搁置。耐高渗酵母醋酸杆菌属(1)(2)CH2OHHCCHOHOHCCH2OHOHD-Xylulose假丝酵母菌属(3)图1木糖醇多菌多步法生产工艺路线图Fig.1.Theprocessofxylitolsynthesisbymultibacteria.3.2两菌两步转化葡萄糖生成木糖醇2002年，日本味之素株式会社Suzuki等选育到一株将阿拉伯糖醇一步高效生物转化为木糖醇的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)，将上述木糖醇生物合成路线简化为两菌两步法，第一步利用酵母菌发酵葡萄糖高效制备D-阿拉伯糖醇，第二步由该菌高效转化D-阿拉伯糖醇制备木糖醇[18,19]。其工艺路线如图2所示。耐高渗酵母氧化葡萄糖酸杆菌属(1)(2)图2木糖醇两菌两步法生产工艺路线图Fig.2.Theprocessofxylitolsynthesisbytwobacteria.此工艺第二步，即从D-阿拉伯糖醇转化成木糖醇过程中，实际为两个酶催化过程(反应式如图3所示)，第一个为膜结合D-阿拉伯糖醇脱氢酶(membraneboundD-Arabitoldehydrogenase,m-ArDH)，第二个为木糖醇脱氢酶(Xylitoldehydrogenase,XDH)。此法工艺简单、高效，木糖醇对D-阿拉伯糖醇的转化率可达98%，具备了工业化应用的潜力，经济上能与目前所使用的化学法相竞争。CH2OHCHHOCHHOHCOHCH2OHD-ArabitolCH2OHCCHHOHCOHCH2OHOD-XyluloseCH2OHHCOHCHHOHCOHCH2OHXylitolNADHNAD+XDHArDH图3氧化葡萄糖酸杆菌催化D-阿拉伯糖醇产木糖醇的合成途径Fig.3.ThepathwayofxylitolsynthesisfromD-arabitolbyG.oxydans目前，国内已经开展以用淀粉为原料利用两菌两步法来制备木糖醇的研究，着重选育副产物少可耐受高浓度产物的D-阿拉伯糖醇生产菌株及高效转化D-阿拉伯糖醇产木糖醇菌株；如果这一方法成功的话，可以有效改变木糖醇的高消耗、低收率状态。全生物法生产1t木糖醇消耗2～2.5t淀粉，酸、碱消耗降低到0.1t、活性碳消耗降至2%、树脂消耗降至1kg以下。3.3基因工程菌一步发酵葡萄糖生成木糖醇进入21世纪，随着生物技术进步，构建一步发酵葡萄糖生产木糖醇的基因工程菌成为了研究热点。2007年，Danisco公司利用Bacillussubtilis有较强五碳糖合成能力的特点，以此菌为宿主菌，克隆表达了木糖醇磷酸脱氢酶(Xylitolphosphatedehydrogenase,XPDH)基因，在原有途径基础上延伸木糖醇合成途径(图4A)，结果这株工程菌的葡萄糖摇瓶发酵生产木糖醇浓度达23g/L，对葡萄糖转化率为22%[20]。同年，芬兰国立技术研究中心(VTT)和Danisco公司合作研究，以普通酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为宿主菌，在原有的磷酸戊糖途径(Pentosephosphatepathway,PPP)基础上，增加了木糖醇脱氢酶(XDH)和磷酸糖磷酸酶(Sugarphosphatephosphatase,Ptase)两个酶基因，延长了木酮糖-5P到木糖醇路线(见图4B)[21]。XPDHAB23%2.7%2%4.5%1.5%2%30%葡萄糖葡萄糖-6P核糖醇核糖醇-5P核酮糖-5P核酮糖木酮糖木酮糖-5P木糖醇-5P木糖醇XPDH核酮糖-5P木酮糖-5P木酮糖木糖醇XDH核酮糖核糖-5P核糖核糖醇XDH葡萄糖乙醇PtasePtasePtaseXPDH：磷酸木糖醇脱氢酶；Ptase：磷酸糖磷酸酶。副产物代谢途径；“P”-代表磷酸脂部分;外源导入或过量表达的酶；m-ArDH：膜结合阿拉伯糖醇脱氢酶；XDH：木糖醇脱氢酶；图4一步法发酵葡萄糖生产木糖醇工艺路线图A:Danisco公司构建的基因工程菌B.subtilis中木糖醇的代谢途径；B:Danisco公司和VTT研究中心构建的S.cerevisiae中木糖醇的代谢途径；Fig.4.Theprocessofxylitolsynthesisbygeneticalbacteria.A:ThemetabolicpathwaysofxylitolinB.subtilisconstructedbyDanisco.B:ThemetabolicpathwaysofxylitolinS.cerevisiaeconstructedbyDaniscoandVTT.在一步发酵法中，Danisco公司及其和VTT技术研究中心所构建的两株基因工程菌株由于存在出发菌株性能较差、关键酶基因表达活性不高、底物特异性不强等缺点，尚无法达到预期的目标。此外，若能在D-阿拉伯糖醇产生菌株的基础上，利用基因工程技术，延长D-阿拉伯糖醇的代谢途径，可实现菌株一步发酵葡萄糖产木糖醇。同时在对发酵过程进行动力学分析