木聚糖酶基因肠道特异性表达载体的构建

木聚糖酶基因肠道特异性表达载体的构建及转基因细胞的获得报告人：陈章林导师：张豪老师2010-12-7内容研究背景研究现状研究的目的与意义技术路线工作计划与经费预算主要参考文献研究背景木聚糖目前，我国用作畜禽饲料的谷物中含有一种抗营养因子--“木聚糖”。它是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳水化合物总量的1/3，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的再生生物质资源。木聚糖存在于陆生植物的细胞壁中，几乎植株的所有部位都含有，是一种杂合多聚分子,主链由多个吡喃木糖基通过木糖苷键相连。饲料中的木聚糖未被有效利用，造成很大的资源浪费。它阻止细胞内养分释放、增加食糜黏度、阻碍饲料营养物质与消化液的接触、增加肠道不动水层厚度、使消化器官代偿性增大、增加内源损失、影响消化道生理活性物质的活性、破坏肠道正常结构和微生态平衡等，最终会影响养分的消化吸收和动物的生长性能。它在谷物中的存在大大限制了谷物在养殖业中的应用。木聚糖酶木聚糖酶以内切方式作用于木聚糖分子中β-1，4-木糖苷键。其主要水解产物为木二糖与木二糖以上的低聚木糖，还有少量木糖和阿拉伯糖，是一类木聚糖降解酶系，属于水解酶类，包括内切β-木聚糖酶、外切β-木聚糖酶和β-木二糖苷酶，在饲料、造纸、食品以及能源工业中有着广泛的用途（邓萍，2006；Krisanaetal.,2005）。近年来，木聚糖酶作为环保型饲料添加剂广泛应用于畜牧业（费笛波等，2004），可改善消化道功能、增强免疫力、提高饲料利用率的生产性能、减少粪便对环境的污染（杨会涛等，2007）。然而，饲粮中木聚糖与木聚糖酶的定量关系尚未建立。谷物中木聚糖含量受种类、品种、产地、环境、气候、收割时间、加工、测定方法等因素的影响，不同品种或不同来源的同种类谷物其总木聚糖和水溶性木聚糖的含量、结构也存在差异，导致饲粮中木聚糖酶添加量尚难确定。另外，木聚糖酶作用效果的评价方法也需进一步探讨。这些问题使饲料中作为添加剂的木聚糖酶难以达到人们满意的效果。肠激酶肠激酶(Enterokinase,EK或Enteropeptidase,EP,EC3.4.21.9)是存在于哺乳动物十二指肠粘膜分泌的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶，使胰蛋白酶原激活形成有活性的胰蛋白酶。肠激酶与胰蛋白酶同属丝氨酸蛋白酶家族，只作用于碱性氨基酸C末端肽键，堪称蛋白酶中特异性最严密的酶。肠激酶分子质量为150ku，由1条115ku重链和1条35ku轻链组成,在pH值4.5~9.5、温度4~45e范围内特异性水解蛋白底物。木聚糖酶和木聚糖酶基因的研究是当前酶学研究热点之一。已报道的能产木聚糖酶的微生物有细菌、链霉菌、曲菌和青霉等。目前使用的木聚糖酶主要是利用米曲霉、黑曲霉、芽孢杆菌和酵母菌等发酵后，经提取、浓缩等工艺加工而成（郭志强等，2008）。研究现状黑曲霉产生的木聚糖酶具有良好的酸碱性，动物胃肠道内的温度和PH值对该木聚糖酶的活性影响不明显，这是其在畜禽及水产动物饲料中的应用有独特的优势（聂国兴等，2003）。到目前为止，已有很多来源于微生物的木聚糖酶基因被克隆并且进行了原核和真核表达，原核表达主要在大肠杆菌中表达，真核表达主要在酵母表达系统、昆虫表达系统、动物乳腺表达系统、丝状真菌外源表达系统等系统中表达（刘寅，2006）。研究目的与意义随着动物转基因技术的不断发展，利用动物内源性的消化道来产生木聚糖酶成为一种新的研究策略和思路。本实验拟采用猪肠道特异表达的肠激酶基因的启动子成分与黑曲霉木聚糖酶基因，构建在猪肠道特异高效表达的重组体，利用猪内源产生大量的木聚糖酶消化分解饲料中的木聚糖，来解决上述出现的问题。通过本实验获得猪肠道高效特异表达载体，继而获得肠道特异表达的转木聚糖酶基因的猪肠道细胞系。得到的转基因阳性细胞可以作为供体用于体细胞核移植，从而获得整合木聚糖酶基因的克隆胚胎，为研究转基因猪奠定了基础。技术路线猪肠激酶基因上游调控区克隆及功能验证木聚糖酶基因原核真核分泌表达构建猪肠道特异表达的木聚糖酶转基因表达载体转染猪肠道细胞筛选、鉴定阳性转木聚糖酶基因细胞黑曲霉木聚糖酶基因克隆猪肠激酶基因上游调控区克隆及功能验证NCBI上猪肠激酶基因序列已经全部公布出来，预想将该基因的5‘端克隆出来，检测活性，用作肠道特异表达的启动子。抽提猪总DNA肠激酶基因上游调控片段克隆细胞转染报告基因载体构建与鉴定报告基因活性检测工作计划与经费预算时间试验内容经费预算（5万）2010.6-2010.7黑曲霉木聚糖酶基因获得与真核表达80002010.6-2010.12猪肠道特异表达基因寻找，期望得到其上游调控区。筛选出猪小肠粘膜上特异表达肠激酶基因PRSS7和Cdx280002011.1-2010.6构建猪肠道特异表达载体180002011.7-2011.9猪肠道细胞的培养与含目的基因特异表达载体转染80002011.10-2011.12转基因细胞的筛选与鉴定8000主要参考文献尹海芳.猪腮腺分泌蛋白基因的克隆及消除磷污染植酸酶转基因小鼠模型的建立.中国农业大学博士学位论文.2003尹海芳等.猪腮腺分泌蛋白基因序列和蛋白结构比较分析及组织表达谱鉴定.科学通报第48卷第13期2003年7月张茂等.黑曲霉木聚糖酶基因（xynB）的克隆和真核分泌表达.农业生物技术学报，2010年，第18期，第2卷，第368-373页袁天杰.sfat-1基因乳腺特异性表达载体的构建及转基因细胞的获得.硕士.中国农业科学院.2009年王修启,陈杰,林东慷,等.皖麦38添加木聚糖酶对鸡表观代谢能值和氨基酸表观消化率的影响[J].华北农学报,2003,18（1）:116-118.谭权,张克英.木聚糖的抗营养作用[J].中国家禽,2008,30(12):55-57.FangHY,ChangSM,LanCH,FangTJ.PurificationandcharacterizationofaxylanasefromAspergilluscarneusM34anditspotentialuseinphotoprotectantpreparation.ProcessBiochem2008;43:49–55.CollinsT,GerdayC,FellerG.Xylanases,xylanasefamiliesandextremophilicxylanases.FEMSMicrobiolRev2005;29:3–23.SergueiP.Golovan.eat.Transgenicmiceexpressingbacterialphytaseasamodelforphosphoruspollutioncontrol.NaturePublishingGroup2001请大家批评指正！谢谢！