本次实验课涉及的实验内容包括

-1-本次实验课涉及的实验内容包括：实验十七：血清γ球蛋白的提纯，P96；以及实验八：醋酸纤维素薄膜电泳本实验的目的是：掌握蛋白质提纯的方法及原理；了解蛋白质提纯的流程。总体操作流程：（同时介绍时间安排，有利于学生安排自己的时间）盐析20min离心10min层析60min显色反应10min泡醋酸纤维素薄膜10min午休60min(11:40-12:40,不同的组别不同的时间,提醒早来的同学看下午的实验步骤)浓缩10min点样30min电泳50min看结果15min先讲解盐析的操作1.步骤2ml兔血清+2mlPBS+2ml饱和(NH4)2SO42.强调最后加完血清的同学用蒸馏水将吸量管冲洗干净3.强调(NH4)2SO4的加入应该是边加边震荡，几乎是加一滴震荡均匀，以免局部盐浓度过高或过低，沉淀的蛋白不全是γ球蛋白。[原理一:盐析SaltingOutTechnique]在大部分同学都做完了的时候讲一、概念：（提问，然后再写板书）在蛋白质溶液中加入大量的中性盐使蛋白质沉淀析出的方法（技术）这个概念学生可以参考32页的内容，概念里讲述了用哪些盐，和盐析的原理二、应用：（初步，粗）提纯蛋白质三、原理(提问)：1蛋白质在水溶液中的稳定性因素？2中性盐是否可以破坏这两个稳定性因素？四、盐的选择：蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，由下表可以看出：它的优点是温度系数小而溶解度大（20度时饱和溶液为754克/升；0度时饱和溶解度为706克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。为什么选择(NH4)2SO4来做盐析？1溶解度大，温度系数小2物美价廉3不使蛋白质变性4缺点：NH4+干扰双缩脲反应：除-CO-NH-有双缩脲反应外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。可测定的范围为1～10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大。干-2-扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如TrIs缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。五、盐析提纯蛋白质的其它条件1温度2pH:所用盐溶液的pH与被提纯（或者说被沉淀的蛋白质）的pI应该有何关系？盐溶：saltingin在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。这种现象称为盐溶。盐析法提纯的抗原浓度不高，只用于抗原的初步纯化。六、Ks分段盐析，β分段盐析盐析原理一般是指溶液中加入无机盐类而使溶解的物质析出的过程。如：加浓（NH4）2SO4使蛋白质凝聚的过程。2L!H%n(F7a+Z:_#q蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。盐析的优缺点)@9n.d#}4P2z1.成本低，不需要特别昂贵的设备。2.操作简单、安全。3.不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。3p4.效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。盐析实验步骤蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，由下表可以看出：它的优点是温度系数小而溶解度大（20度时饱和溶液为754克/升；0度时饱和溶解度为706克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。)w3L4~8l:z,a)s饱和硫酸铵法#t(Z'm3B$L+M7D6L0r(P3J1.取xml血清加xml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。0L!y(l)D4d:T0[3.置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为蛋白，以0.02%mol/LpH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。.K-D;^,Da4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，-3-即把蛋白质溶液装入透析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。i2C%~0R*F&{5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。+a,z![2^4E0?,_3|方法如下:蛋白含量(mg／ml)＝(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×样品稀释度。注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长5N,v,[9[;}%F;Y(n$r分段盐析&h7{#`+m6c,h+r,CJ对分离目的蛋白的盐析，最好采用分段盐析。由于不同的蛋白质其溶解度与等电点不同，沉淀时所需的pH值与离子强度也不相同，改变盐的浓度与溶液的pH值，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开，这种分离蛋白质的方法称为分段盐析法(fractionalsaltingout)。如半饱和硫酸铵可沉淀血浆球蛋白，饱和硫酸铵则可沉淀包括血浆清蛋白在内的全部蛋白质。&g$I'N)]!R0I$T1.分段盐析的条件先需要进行小实验探索，如：先进行0%-30%的硫酸铵沉淀，再进行30%-60%的硫酸铵沉淀，最后进行60%-80%的硫酸铵沉淀。2.每一段盐析静置之后都将离心取沉淀，透析并检测活性。通过实验结果可以看出哪一段盐析出来的目的产物最多，相对来说杂质就更少。O-a6m*B5x'K'f3.比如实验中的活性物质主要在60%-80%这段出来，在以后的实验中，就可以首先进行0%-60%的硫酸铵沉淀，这段沉淀物可以抛弃（去处大多数杂质）；然后进行60%-80%的硫酸铵沉淀，这段沉淀出来是物质是所需要的目的物质含量比较高的物质，将其收集进行下一步纯化工作。盐析曲线的制作1E;D(X-E)c如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH值，分6～10次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到6～10个级分，按照每次加入硫酸铵的量，查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。盐析注意事项1.盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。2.盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60摄氏度烘干后再称量，这样更准确。3.在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。2y4w'z%v$g*r%W;}'i%M'U4.盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。3.5为了-4-避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。5.盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者G-25，G-50处理。6.一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在70%左右。盐析影响因素(M6L:D0R+Z)T1．蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25mg/mL～30mg/mL。2．离子强度:各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。3．盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。$G2A*U$\x[8y#d4．PH值：&v#n*N2N/q(L一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。,W/I)I,]*\*l(i2B5．温度：)U:h3j!s:s除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。6．蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。盐析时，分子量较小的蛋白质逐步沉淀下来可能就值得怀疑。具体的蛋白需要具体的摸索，当然，对肽来说，结论也是一样的。盐析常见问题分析+r91.硫酸铵沉淀到底能否把蛋白按分子量分开？硫酸氨沉淀的机理其实就是盐析（saltout）。一般而言蛋白质在溶液里面溶解度和盐浓度有关系。在低盐浓度下，如果增加盐浓度，会增强蛋白质的溶解，这是因为，盐的离子与蛋白质表面的正负电荷配对，减少了蛋白质电荷表面相互作用的机会。当盐浓度高到一定程度的时候，过多的盐会跟蛋白质疏水表面争夺水分子，以至于蛋白质疏水表面倾向于相互作用形成聚合物沉淀下来。0^4_({4f]+Y8`4b9M.h相对来说，分子量大的蛋白质量比较容易发生沉淀，但实际上影响因素很多,比如溶液PH,蛋白浓度,有无非蛋白质成分等,而分子量只是众多影响因素之一。因此，想根据蛋白质分子量的不同利用硫酸氨沉淀将其分开,不是可取的方法。盐析法是利用抗体与杂质蛋白蛋白对盐浓度的敏感程度的差异来进行分离。实际上就是利用溶解度的差异进行分离。拿抗体溶液来说，当硫酸铵饱和溶液达到20%时，纤维素蛋白首先析出，当28%-33%大部分优球蛋白析出当33%-50%-5-时球蛋白析出，大于50%其他杂蛋白析出。从这几种蛋白的析出顺序看，好像与蛋白的分子量有一定的关系，优球蛋白分子量达到上千亿，球蛋白（IgG）十几万，分子量相差太悬殊了，从化学的角度看，对于同数量级别的分子来说，其溶解度与分子量是没有太大关系的。所以想把不同分子量的蛋白分离开比较费劲。2.酶在盐析时上清和沉淀中酶活差不多一样高;在与酶等电点相同的缓冲液中透析24hrs后,酶活基本丧失;还有，对透析后的沉淀用提取液溶解,有不溶物,为什么？缓冲液pH选的对不?沉淀是用提取液溶解吗？酶在盐析时上清和沉淀中酶活差不多一样高,说明盐浓度不够，应增加盐的浓度，使酶大部分沉淀下来，直到上清中检测不到该酶为止。或者考虑一下过高的盐离子会不会影响酶活测定。盐浓度越高，对蛋白质活性的影响越大，也会有越多的不溶蛋白质（当然也