教你如何阅读质粒图谱

一、一个合格质粒的组成要素复制起始位点Ori，即控制复制起始的位点。原核生物dna分子中只有一个复制起始点。而真核生物dna分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+，kan+多l克隆位点：mcs克隆携带外源基因片段P/E：启动子/增强子Terms：终止信号加poly（A）信号：可以起到稳定mrna作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记：（1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr：可以阻止四环素进入细胞。（3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。（5）hygr：使潮霉素β失活。第三步：看多克隆位点（mcs）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源dna插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源dna片段。一般来说，外源dna片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。相关概念：启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与rnapol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。增强子/沉默子－为真核l基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子－负增强子，负调控序列。核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mrna有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是aug（起始密码）和SD序列。l转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段gt或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段gt或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。三、载体及其分类载体：即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。载体的分类按功能分成：（1）克隆载体：都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨型载体）（2）表达载体：具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttlevector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）。P.S.穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。基因工程载体的3个特点：（一）都能独立自主的复制：载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如mcs，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。（二）都能便利的加以检测：如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。四、载体的选择和制备选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点：1、构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。2、载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如小于10kb选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意3点：①选择合适的启动子及相应的受体菌；②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。3、载体mcs中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。选用质粒（最常用）做载体的4点要求：①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒小于10个。③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。二、pET32a(+)自身载体表达的片段大小TheexpectedfusionproteinexpressedencodedbyjustthepET-32a(+)vectoralonewouldbearound20.4kDa.TheTrx-tagbyitselfwouldcontribute12kDa.TherestisduetothetwoHis-tags(0.8kDaeach)andtheS-tag(1.7kDa).Theremaining5.1kDaisduetotheintervening（?）54aminoacidsbetweenthetagsanduntilthestopcodon.三、pET32系列载体的载体序列地址四、pET系列载体阅读方法ori是复制起始点，细的黑箭头是几个不同的转录区，其箭头方向不同，说明每个表达产物（如kan抗性基因、LacI等）都有独立的promoter，有时与T7promoter方向相反。粗的黑箭头是mcs，用于目的基因的插入，箭头方向表明目的基因的转录方向，它的转录方向可以与其它几个不同的转录区相同，也可以不同，如kan抗性基因、LacI的方向是一样的，可能与调控相关，不同的载体是不一样的。一个载体可只看它的启动子到终止子那一段，其它的可以考虑少些。五、pET表达菌株的相关信息（DE3）指宿主为λDE3溶原菌，其染色体上带有一拷贝由lacUV5启动子控制的T7rna聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到pET载体的目标基因生产蛋白。命名为pLysS和pLysE的宿主菌带有编码T7溶菌酶（为T7rna聚合酶的天然抑制物）的pET相容性质粒。带有pLysS的细胞产生少量溶菌酶，而pLysE宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制T7RNA聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的pET重组体。带有pLacI的宿主菌产生额外的抑制pETBlue和pTriEx载体基础表达的lac阻遏蛋白。λDE3溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。AD494菌株为硫氧还蛋白还原酶(trxB)突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。TrxB突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的质粒。B834为BL21的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用35S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。BL21应用最广的宿主菌来源，具有lon和ompT蛋白酶缺陷的优点。BL21TrxB菌株在蛋白酶缺陷BL21背景上具有与AD494菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变(trxB)。由于trxB宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。TrxB突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的质粒。BLR为BL21的recA-衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起DE3噬菌体丢失的目标质粒。HMS174菌株在K-12背景上提供了recA突变。与BLR一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起DE3噬菌体丢失的某些目标基因。NovaBlue适合用作初始克隆宿主菌的K-12菌株，具有高转化效率、蓝/白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒DNA高产的recAendA突变。由于存在F附加体编码的lacIq阻遏蛋白，NovaBlue的DE3溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。Origami为K-12衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似，Origami（DE3）表达的活性蛋白比其它宿主菌高10倍以上。Origami宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于pET-32载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。TrxB和gor突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的pET质粒。OrigamiB宿主菌来源于BL21lacZY突变株，还带有与原始Origami菌株相同的TrxB/gor突变。OrigamiB菌株集BL21、Tuner和Origami宿主菌的优点于一体。TrxB和gor突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的pET质粒。Rosetta宿主菌从BL21衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、aga、cua、ccc和GGA的tRNAs。这样Rosetta菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。tRNA基因由它们的天然启动子驱动。在Rosetta（DE3）pLysS和Rosetta（DE3）pLacI中，稀有tRNA基因存在于分别带有T7溶菌酶和lac阻遏基因的同一质粒上。Tuner菌株为BL21的lacZY缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。lac通透酶（lacY）突变使得iptg均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整IPTG浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与pET载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。Tuner（DE3）pLacI菌株与pETBlue和pTriEx载体的表达相容。