题目:细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定一、实验原理:筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节:诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。本实验选用亚硝酸钠为诱变剂来诱发突变,并用青霉素法淘汰野生型,逐个测定法检出缺陷型,最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。二、实验器材:离心机,冰箱,恒温箱,高压灭菌锅;接种针,三角烧瓶,试管,离心管,移液管,培养皿,枪头三、菌种:大肠杆菌四、所有用到的培养基:(分别列出配方)1.LB培养液:酵母膏,0.5g;蛋白胨,1g;NaCl,0.5g;水,100ml,pH7.2121℃灭菌15min2.基本培养基:葡萄糖0.5g,(NH4)2SO40.1g,柠檬酸钠0.1g,MgSO4·7H2O0.02g,K2HPO40.4g,KH2PO40.6g,重蒸水100mL,pH7.2,110℃灭菌20min。配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂。全部药品需用分析纯,使用的器皿需用蒸馏水或重蒸水冲洗2~3次。3.无N基本液体培养基:K2HPO4,0.7g;KH2PO4,0.3g;柠檬酸钠3H2O,0.5g;MgSO47H2O,0.01g;葡萄糖2g;水100ml,pH7.0110℃灭菌20min4.2N基本培养基:K2HPO4,0.7g;KH2PO4,0.3g;柠檬酸钠3H2O,0.5g;MgSO47H2O,0.01g;(NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g;水100ml,pH7.0110℃灭菌20min5.完全培养基同LB培养基,配置固体培养基,需加2%的琼脂。6.补充培养基(简称SM):为满足某特定营养缺陷型菌株的营养要求而在基本培养基中加入某—种或几种营养成分的培养基称补充培养基。7.醋酸缓冲液(pH4.5)(取醋酸钠18g,加冰醋酸9.8ml,再加水稀释至1000ml)、0.1mol/L亚硝酸钠溶液(68.995×0.1=6.8995g/L)、0.07mol/L酸氢二钠溶液(pH8.6)(141.96×0.07=9.9372g/L)五、实验步骤1thday:各种所需培养基、试剂的配制及所需器材灭菌2thday:菌体活化与培养:取一环E.coli于5mlLB液体三角瓶中,37℃培养过夜,14~16h.3thday:早上添加5mlLB液,充分混匀后,分装到两只三角瓶,继续培养5小时。将两瓶菌液分别倒入离心管中,离心(3500rpm)10分钟,弃上清,其中一管加生理盐水5ml,打匀沉淀,然后倒入另一离心管中,两管合并成一管。(菌体密度控制在10*7~10*8个/mL)。菌液浓度测定比浊计数法(OD600=1,枯草芽孢杆菌浓度为6×10*个/mL)。亚硝酸钠(NIT)诱变:取菌悬液1mL、醋酸缓冲液(pH4.5)2mL、0.1mol/L亚硝酸钠溶液1mL,于26摄氏度下保温25min后每个样中,加入0.07mol/L磷酸氢二钠溶液(pH8.6)20mL,以终止反应。然后取诱变菌液1mL稀释涂布于LB琼脂平板上,在30℃下培养48h后进行菌落计数,计算致死率.(三)营养缺陷型浓缩(淘汰野生型)3thday:延迟处理:吸菌液5ml于离心管中,3500rpm离心10min,弃上清。离心洗涤两次(加生理盐水至原体积,打匀沉淀,离心,弃上清,重复一次),最后加生理盐水制成5ml菌悬液。取0.1ml菌液于5ml无N培养基中,37℃培养12h。4thday:初筛:加入等体积2N基本培养液5ml,加5万U/ml青霉素钠盐溶液100ul(1国际单位(IU)=0.60μg结晶青霉素G钠盐=0.625μg结晶青霉素G钾盐),使青霉素在溶液中的最终浓度约为500U/ml(青霉素母液过滤除菌后加入),再放入37℃培养。(四)营养缺陷型检出5thday:从培养12、16、22小时(根据实际情况,选择2-3个时间段)的菌液中分别取0.1ml菌液到基本及完全培养基两个培养皿中,涂布,37℃培养。7thday:检出营养缺陷型。上述平板培养36-48h后,进行菌落计数。(五)复证:选取完全培养基上长的菌落数大大超过基本培养基的那一组,用灭菌牙签挑取完全培养基上长出的菌落100个分别点种于基本培养基和完全培养基上(先基本,后完全),37℃培养。9thday:选在基本培养基上不长,完全培养基上生长的菌落在基本培养基上划线,37℃培养24h,仍不长的是营养缺陷型。(六)生长谱测定使用以下四种营养物质:a.不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合液酪素水解液的配制:1g干酪素溶于碱性缓冲液(Tris-HCl、PBS)中,加入1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL加水至100mL,30℃水解lh。(用于配制培养基时,其用量为1000mL培养基中加入100mL以上水解液。)b.维生素混合液c.0.1%碱水解酵母核酸液d.酵母浸出物10thday:生长谱的测定:将检出的营养缺陷型菌落接种于5mlLB液试管中,37℃培养14-16h。11thday:培养16h的菌液离心。3500rpm,10min,弃上清,加生理盐水,打匀沉淀,再次离心。加5ml生理盐水制成菌悬液。取其1ml于培养皿中,加入融化后冷却到40-50℃的基本培养基,混匀,平放,共二皿。(平板表面分别沾上沾有以上四种营养物质的滤纸片,30℃培养24h,经培养后营养物质周围有生长圈,即表明为此类物质的营养缺陷型菌株)。将皿底分成分格用接种环依次放入少许营养物质,37℃培养24h,观察生长情况,确定是哪种氨基酸营养缺陷型。诱变处理的记录:菌落数12h16h22h完全培养基基本培养基