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细胞生物学实验报告染色体标本的制备及组型观察1.实验目的：掌握染色体标本制作的基本方法；认识不同生物的染色体的状态，学会做染色体组型图。2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、离心管、离心机、小烧杯、冰箱、酒精灯、小烧杯（1）实验药品：蒸馏水、0.9%NaCl溶液、0.3%KCl溶液，固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、秋水仙素（2）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）制作染色体标本的意义：了解染色体的特征（形态、大小、数目）——绘制染色体组型图染色体组型：把真核动物一个体细胞各染色体按长度、形状、着丝粒位置排列成一定顺序。染色体核型：某一物种特有的一组或一套染色体的形态特征。（2）染色体组型图的应用①鉴别生物种类：兔44条；小鼠40条；大鼠42条；鸡78条；猫38条；狗78条；马64条②遗传病的诊断和研究：三体综合征（含三条21号染色体）、卵巢退化症（含45条染色体，比正常人缺少一条性染色体）、睾丸退化症（含47条染色体，比正常人多一条X或Y染色体）等因此，我们可以给孕妇抽取羊水检查器胎儿的染色体，做遗传病早期诊断。（3）染色体标本的制作①观察：由于分裂期中期的染色体染色体凝集程度最高，因而我们应尽量使细胞停留在分裂期中期以便观察。②细胞：为尽量看到多的染色体，我们应当选取具有旺盛分裂能力的细胞，这样的细胞可以来自:胸腺、骨髓、睾丸、小肠等。我们在此实验中使用的是小鼠的精巢细胞。在做人的染色体标本时，我们使用的是血液里的淋巴细胞。③药物：PHA（植物细胞凝集素）：PHA具有促进细胞凝集和分裂的作用。PHA可以使血液中的淋巴细胞还原至淋巴母细胞（只存在于骨髓中）秋水仙素：秋水仙素可以破坏微管的组装，纺锤体不能形成，细胞分裂停在中期。与秋水仙素作用相同的药物还有长春花碱、鬼臼素、苯环己烯等。可以促进胃管组装的药物有紫杉酚、重水等。④空气干燥：使细胞与染色体易于分离⑤低渗作用：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体距离变大，易于分离、展平。⑥固定：Camoy’ssolution,使组蛋白变性（变硬），维持染色体原有形态（4）描述染色体的四个参数①相对长度=（每条染色体的长度）/（单倍常染色体之和+X染色体）*100相对长度可以用来表示每条染色体的长度②臂指数=（长臂的长度）/(短臂的长度)臂指数可以用来确定臂的长度为了更准确的区别亚中部和亚端部着丝粒染色体1964年Levan提出划分标准：臂指数在1.0-1.7之间，为中部着丝粒染色体（M）；1.7-3.0之间，为亚中部着丝粒染色体（SM）；3.0-7.0之间，为亚端部着丝粒染色体（ST）；7.0以上，为端部着丝粒染色体（T）③着丝粒指数=（断臂长度）/（染色体全长）*100着丝粒指数可以决定着丝粒的相对位置按Levan的划分标准，着丝粒指数在50.0-37.5之间，为M；37.5-25.0之间，为SM；25.0-12.5之间，为ST；12.5-0.0之间，为T④染色体臂数（NF），根据着丝粒的位置来确定端着丝粒染色体（T），NF=1中部，亚中部，亚端部着丝粒染色体（M,SM,ST）,NF=2（5）视野中染色体可能是20或40条左右，因为细胞可能处于减数第一次分裂和减数第二期分裂时期。4.实验步骤：（1）取雄性小鼠，以每克体重4微克注射秋水仙素（约1mL），14-16h后，用断头法处死小鼠，取出睾丸用生理盐水（0.9%NaCl溶液）洗去血污，置于解剖盘中。（2）将睾丸放入装有1mL0.3%KCl溶液的小烧杯中剪碎（液体呈乳白色）。（3）用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%KCl溶液至4mL。（4）37℃静置30mins，低渗处理。（5）以800-1000r/min离心8分钟。（6）弃上清液，加入2mL甲醇·冰醋酸固定液。用吸管吹气，轻轻打散细胞，固定8mins。（7）再以800-1000r/min离心8分钟。（8）弃上清液，加入1mL甲醇·冰醋酸固定液制成细胞悬液，固定5mins。（9）取去洁净的低温预冷载片，距10-15cm的高度滴下2-3滴细胞悬液，从一边轻轻吹气，并随时轻轻敲打，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。（10）用滤纸擦去载片上的多余液体，空气干燥或文火干燥，染色30-35mins。5.实验结果：视野中可见细胞分裂期中期细胞，呈棒状，有个别染色体被展开呈V字形，视野中也可见大量精子，处于分裂期但不是分裂中期的细胞。10*40显微镜下观察：（1）普通细胞普通细胞中，中期染色体40条（2）精子精子中，中期染色体20条6.分析与讨论（1）结果分析：本实验采用的是小鼠的精巢，所以视野中可见大量的精子，它们有一个比较圆的头部和鞭毛，有部分细胞在进行减数第一次分裂的中期，这样的细胞是二倍体，可观察到40条染色体，有些在进行减数第二次分裂中期，这样的细胞是单倍体，应有20条染色体。还有一些细胞处于细胞分裂期，但不是中期，可以观察到凝集程度不是很好的染色体。但是，实验中没有得到完全展开好的染色体，染色体大多呈棒状而不是V字形，这说明在对染色体展平的步骤没有做好，以后应改进。（2）注意事项①注射秋水仙素：应选择腹腔注射，如果观察到小鼠被注射后皮肤隆起，则表明注射到皮下，应重新注射；如果在拔出针时观察到有血珠溢出，则是因为注射时损伤了部分器官或血管，秋水仙素会随血液传递到全身，其传递速度会加快，其死亡时间可能小于15-16h，应随时观察小鼠，以防其突然死亡。即使注射到小鼠的腹腔中，也很有可能注射到起脂肪组织中，使小鼠的死亡时间变慢。因此应根据具体实验，适当调整注射时间和等待时间。②处死小鼠：最好选择在小鼠将要死亡时处死小鼠，因为此时，秋水仙素的作用发挥到最大，分裂期中期的细胞最多；如果等小鼠死亡后处死小鼠，小鼠尸体可能已僵硬，难以取到精巢。③剪碎组织：可以取少于1mL0.3%KCl溶液，没过杯底即可，如果液体太多则很难剪到组织，比较浪费时间。④铜网过滤：应把组织尽量剪碎后再用铜网过滤；如果烧杯中仍有较大颗粒，则小心不要把那些颗粒倒出，在烧杯中再加入少量0.3%KCl溶液，继续剪；如果铜网上还有很多比较大的颗粒，先用少量0.3%KCl溶液将其冲入烧杯，再进行剪碎。⑤实验步骤中的（4）所提到的30mins包括包括（5）中的离心配平时间，因此，真正的静置时间应少于30mins，细胞与0.3%KCl接触的总时间应为45mins左右。另外，由于是在冬季做实验，我们可适当延长低渗时间。如果在最后的镜检时，观察到细胞呈圆形，比较膨胀，即证明低渗这一步骤的成功。反之，如果低渗不成功，则细胞会比较瘪，且这样的细胞很难摔碎。⑥离心：离心的转速是800-1000r/min，这样低的转速是为了防止细胞破裂。⑦再次离心和固定：这样做是因为第一次离心之前细胞经过了低渗处理，虽然抽去了上清液，但是不可能抽干净，因此，再次离心保证细胞离开低渗环境。⑧吹散细胞：应该轻轻地吹细胞，如果太用力会导致细胞破裂。⑨摔碎细胞：摔碎细胞时应注意滴管与载玻片的距离，如果距离太小，则细胞很难摔碎，不会观察到染色体；但如果距离太大，会使细胞完全的碎开，染色体布满视野，虽然观察到染色体，但不能明确分出哪些是同一个细胞的，会给计数造成一定的难度。⑩实际操作发现，细胞很难摔碎，这可以归结为多方面原因。首先，如果在剪碎组织时没有剪好，则会导致细胞匀浆中含有大量细胞团，由于这些细胞聚集在一起，就有一定的组织强度，十几厘米的高度很难摔碎，因此，这一步骤十分关键。然后，如果低渗不完全，细胞可能膨胀程度不够，很难摔碎。再次，如果混匀细胞时没有完全混匀，则会导致细胞聚集在一起，敲细胞时很难敲碎，同样观察不到理想的效果；如果吹得太用力，则会导致细胞被吹碎，视野中有大量细胞碎片，影响观察。当然，如果摔细胞时高度不够，细胞不可能被摔碎。⑪染色：染色之后应冲去染液并晾干，注意使用小水流并从背面冲洗，这样可以避免冲去细胞。染色体疾病：染色体数目或结构异常引起的疾病称为染色体病（chromosomaldisorder）。这类疾病的实质是染色体上的基因或基因群的增减或变位影响了众多基因的表达和作用，严重地破坏了基因的平衡状态，因而妨碍了人体相关器官的分化发育，造成机体形态和功能的异常。严重者在胚胎早期夭折并引起自发流产，故染色体异常易见于自发流产胎儿。少数即使能存活到出生，也往往表现有生长、智力或性发育异常和先天性多发畸形。因此，染色体病对人类危害甚大，且又无治疗良策，目前主要通过遗传咨询和产前诊断予以预防。染色体病表型的轻重程度主要取决于染色体上所累及基因的数量和功能。染色体病按染色体种类和表型可分为三种：常染色体病、性染色体病和染色体异常的携带者。染色体病在临床上和遗传上一般有如下特点：①染色体病患者均有先天性多发畸形（包括特殊面容）、生长、智力或性发育落后、特殊肤纹；②绝大多数染色体病患者呈散发性，即双亲染色体正常，畸变染色体来自双亲生殖细胞或受精卵早期卵裂新发生的染色体畸变，这类患者往往无家族史；③少数染色体结构畸变的患者是由表型正常的双亲遗传而得，其双亲之一为平衡的染色体结构重排携带者，可将畸变的染色体遗传给子代，引起子代的染色体不平衡而致病，这类患者常伴有家族史。5p-综合征：群体发病率为1/50000，在智能低儿中约占1%～1.5％，在小儿染色体病中占1.3％，在常染色体结构异常病儿中居首位。本病的最主要临床特征是患儿在婴幼儿期的哭声非常似小猫的咪咪声，有关研究认为是喉部畸形、松驰、软弱所引起，但也有认为是中枢神经系统器官性或功能性病变引起呼气时喉部漏气所致（表14-7）。大部分患者能活到儿童，少数可活到成年。患者5号染色体短臂缺失的片段大小不一，经多个DAN探针检测，证实5p15为本病缺失片段，即本病是5p15缺失引起。80％的病例为染色体片段的单纯缺失（包括中间缺失），10％为不平衡易位引起，环状染色体或嵌合体则比较少见。大部分病例的染色体畸变是新发生的，呈散发性；但约10%～15％患者为携带者的子代。13三体综合征：新生儿中的发病率约为1/25000，女性明显多于男性。发病率与母亲年龄增大有关。患者的畸形比上述两种综合征严重（表14-7）。99％以上的胎儿流产，出生后45％患儿在1个月内死亡，90％在6个月内死亡。80％的病例为游离型13三体，即47，+13；其发生与母亲年龄有关，额外的13号染色体大多来自母方第一次减数分裂的不分离。其次为易位型，从13q14q为多见，约占易位型的58％，13q13q占38％，13q15q占4％；易位可以是新生的，也可能是亲代为平衡易位携带者遗传而得。当双亲之一是平衡易位携带者时，因绝大多数异常胎儿流产死亡，出生患儿的风险不超过2％；如果双亲之一为13q13q易位携带者，也由于只能产生三体或单体的合子，流产率可达100％，故不宜妊娠，应绝育。少数病例为与正常细胞并存的嵌合型，即46/47，+13，一般体征较轻。18三体综合征：新生儿发病率约为1/3500～1/8000，但在某些地区或季节明显增高，达到1/450～800。男女性别比为1:4，可能女性易存活。患者宫内生长迟缓，小胎盘及单一脐动脉，胎动少，羊水过多，95％胎儿流产；一般过期产，平均妊娠42周；出生时体重低，平均仅2243克，发育如早产儿，吸吮差，反应弱，因严重畸形，出生后不久死亡，出生后1/3在1个月内死亡，50％在2个月内死亡，90％以上1岁内死亡，只有极个别病人活到儿童期（表14-7）。80％患者为47，+18，发生与母亲年龄增大有关；另10％为嵌合型，即46/47，+18；其余为各种易位，主要是18号与D组染色体易位，双亲是平衡易位携带者而导致18三体综合征很少。