新型木聚糖酶在纸浆漂白中的应用

新型木聚糖酶在纸浆漂白应用中的研究乔婧1，樊帅1，符传学1（工业发酵微生物教育部重点实验室工业酶国家工程实验室天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院，天津300457）摘要：本研究从天津广聚源造纸厂及其周边的碱性环境中采集样品，经分离筛选得到一株高产木聚糖酶的细菌，命名为PaenibacilluscampinasensisG1-1(CGMCCNo.5023)。将该基因连接于E.coli/B.megaterium穿梭载体pSTREPHIS1525上，并实现了其在BacillusmegateriumMS941中的分泌表达。纯化后的重组酶XynG1-1最适温度为60℃，最适pH为7，在80℃下保温3h残余酶活为32%，在pH10下保温3h残余酶活为58%。在酶用量为15IU/gpulp，70℃、pH9条件下预处理3h，结果使后续的D0ED1化学漂白中的二氧化氯用量降低50%，并且其纸浆白度没有损失，纸浆的机械强度反而有所增强，可见，由基因工程菌B.megateriumMS941(pSH-XynG1-1)生产的重组木聚糖酶在纸浆漂白方面具有很好的应用前景。关键词：造纸；木聚糖酶；BacillusmegateriumMS941;纸浆漂白；TheResearchonaNewXylanasesAppliedonPulpBleachingQIAOJing1，FANShuai1，FUChuanXue1（KeyLaboratoryofIndustrialFermentationMicrobiology,MinistryofEducation,NationalEngineeringLaboratoryforIndustrialEnzymes,TianjinKeyLaboratoryofIndustrialMicrobiology,CollegeofBiotechnology,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457）Abstract:SamplewerecollectedfromTianjinPaperMillandAlkalineenvironment,andobtainedahighyieldofxylanasebacteriabyisolationandscreening,namedPaenibacilluscampinasensisG1-1(CGMCCNo.5023).Thexylanasegene(xynG1-1)fromPaenibacilluscampinasensisG1-1wasexpressedinBacillusmegateriumMS941andahighlevelofextracellularxylansaeactivity.ApplicationofXynG1-1R(15IU/gpulp)tocottonstalkpulpbleachingincreasedbrightnessby3.65%overthatofthecontrolwithoutthexylanaseandreducedtheneedforchlorinecompoundsby50%withoutlossofbrightnessandpulpfiberqualitiestherecombinantxylanaseproducedbygeneticallyengineeredbacteriaB.megateriumMS941(pSH-XynG1-1)hasagoodprospectofapplicationinpulpbleaching.Keywords:papermaking;xylanase;BacillusmegateriumMS941;pulpbleaching引言造纸工业是我国乃至其他一些国家最大的工业之一，同时也是国民经济的重要支柱产业之一，纸浆生产在给社会带来巨大经济效益和社会效益的同时，也极大地消耗了资源、能源，并造成了严重的环境污染。面对制约造纸工业生存的资源、能源和环境三大问题，只有坚持走节能减排、清洁生产的道路，才能促进造纸工业的可持续发展，国外造纸工业发达国家的前期成功实践已经证明了这一点。因此我国造纸工业也必须走中国特色的清洁生产道路，实现我国造纸工业的可持续生存和可持续发展。在造纸工业清洁生产的各种新技术中，生物酶的应用在减轻制浆造纸工业环境污染、降低能耗、改善纸浆抄造性能等方面具有很大的优势和潜力，呈现了良好前景。近年来，随着国民经济的高速发展，市场对某些纸张白度的要求越来越高，政府对造纸工业排放要求也越来越严格。可见，随着可持续发展战略的实施和对环境保护方面更高的要求，应用生物漂白技术推行清洁生产、减少含氯漂白剂使用对造纸工业的发展将发挥巨大的推动作用木聚糖酶在生物制浆和生物漂白等方面的应用，可以大大减少制浆漂白工序中化学试剂的用量，达到降低环境污染和节约成本的目的，因此，木聚糖酶在造纸工业中有着广泛的应用前景[1]。目前国内外研究较多的是木聚糖酶在纸浆漂白方面的应用，1986年，ViikariL等[2]首次用木聚糖酶处理硫酸盐纸浆，发现木聚糖酶不但能增强漂白纸浆的性能，而且还可以减少后续漂段中氯的用量；随后，WongK.等[3]人应用商品木聚糖酶CartazvmesHS对白杨木的硫酸盐纸浆进行预处理，结果纸浆最终亮度达到了95%，并且减少了18%的氯用量；2011年，Chun-HanKo等在纸浆黑液中分离出产木聚糖酶的菌株Paenibacillussp.2S-6，并将其所产木聚糖酶分离纯化后应用于桉树牛皮纸浆的预漂白实验，结果在大大提高了漂白纸浆的白度和粘度的同时，减少了20%的化学试剂用量[4]。本课题从天然碱性土壤中筛选出高产木聚糖酶的菌株，实现在B.megateriumMS941的高效表达，所产的木聚糖酶最适作用温度为60℃，在80℃下保温3h下残余酶活为32%，在pH10保温3h残余酶活为58%。旨在提高木质素的脱除率和纸浆白度及白度稳定性，大幅度减少后续化学漂白阶段化学药品的用量，减轻纸浆漂白阶段对环境造成的污染，从而实现了纸浆漂白的绿色化。1材料与仪器1.1仪器和试剂TCL-12台式高速冷冻离心机（中国科学院生物物理所技术服务公司）、HH-B11-420型电热恒温培养箱（天津市实验仪器厂）、DYY-III-6B型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）、PTC-200型PCR基因扩增仪（MJResearchInc.）、全自动凝胶成像仪（美国SYNGENE）；蛋白胨，酵母粉（上海生物工程有限公司）、HindⅢ，XhoⅠ,Pyrobest高保真DNA聚合酶，dNTP，DNA连接试剂盒（TaKaRa公司）1.2培养基(1)富集培养基(wt%)：稻壳木聚糖1，蛋白胨0.5，NaCl0.5，MgSO40.03，pH9。(2)选择培养基(wt%)：稻壳木聚糖1，NH4NO30.5，MgSO40.03，NaCl0.5，K2HPO40.2，(NH4)2SO40.1，琼脂1.5，pH9。(3)斜面培养基(wt%)：蛋白胨1，酵母粉0.5，NaCl1，琼脂1.5，pH7。(4)种子培养基(wt%)：蛋白胨1，酵母粉0.5，NaCl1，pH7.0。(5)基本产酶培养基(wt%)：麸皮4，蛋白胨0.5，K2HPO40.5，pH7。(6)LB(Luria-Bertani)培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出5，NaCl10，pH7~7.2；加入1.5%琼脂粉为固体培养基；培养携带质粒的工程菌时加入Amp至终浓度为100g/mL。(7)蓝白斑筛选培养基(g/L)：LB固体培养基，加入IPTG0.4，X-gal4，pH7~7.2。(8)LA培养基(大肠杆菌固体培养基)：LB培养基，1.5%琼脂粉，pH7~7.2，121℃灭菌20min。(9)Amp抗性培养基：LA培养基，121℃灭菌20min，待冷却至60~70℃时，添加氨苄青霉素母液(50mg/mL)至终浓度100μg/mL。2实验方法2.1木聚糖酶产生菌的分离筛选和鉴定2.1.1木聚糖酶产生菌的分离筛选本实验室分别于2010年4月18日在天津泰达地区的盐碱地和2010年5月4日在天津广聚源造纸厂内及周边周边环境中采集样品。对样品进行富集培养，利用平板初筛和摇瓶复筛，获得粗酶液。2.1.2木聚糖酶活性的测定酶活测定方法参照文献[5]6[6]，略做修改。2.1.3菌株的形态学和生理生化鉴定参照《微生物学实验技术》[7]和《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)[8]中菌种鉴定的相关实验方法。2.1.416SrDNA的扩增和序列分析分子生物学的操作方法参照《分子克隆实验指南》[9]。2.2木聚糖酶工程菌的构建2.3.1突变酶基因XynG1的PCR扩增以质粒pET-XynG1为模板，设计上下游引物分别为5’-CGAGCTCGTATGAAAATCTATGGGAAGAGGAGGA-3’(下划线为SacI酶切位点)和5’-CGGGGTACCTCACCGGATCTCCAAATAGTCAATG-3’(下划线为KpnI酶切位点)，进行PCR扩增。2.3.2酶切与连接PCR产物DNA(或载体pSTREPHIS1525)先后用KpnI和SacI进行分步酶切，构建重组质粒，所得重组质粒命名为pSH-XynG1-1。2.3.3巨大芽孢杆菌的转化方法采用原生质体法将pSH-XynG1转化到宿主菌BacillusmegateriumMS941中。2.3.4巨大芽孢杆菌工程菌的诱导发酵挑取重组菌BacillusmegateriumMS941(pSH-XynG1)的单菌落，接入含有10μg/mLTet的LB液体培养基中，37℃、180rpm下培养12~16h后，以2%的接种量转接至含有10μg/mLTet的50mLLB液体培养基(250mL摇瓶)中，37℃、180rpm摇瓶培养至OD600=0.3，加入木糖至终浓度为0.5%，继续培养，进行诱导表达，每隔1h取样测定木聚糖酶酶活及OD600值。2.3.5重组酶的分离纯化应用镍离子亲和层析对重组酶进行分离纯化[10]。2.3.6重组木聚糖酶的酶活测定取0.1mL经适当稀释的酶液，加入等体积1%的桦木木聚糖(Sigma)底物溶液(pH9)混匀，70℃水浴恒温反应10min，立即向试管中加入0.6mLDNS试剂并混匀终止反应，然后在沸水中煮沸10min，冷却后加水定容至5mL，充分摇匀，以灭活酶液做对照，测量样品540nm波长处的吸光度。木聚糖酶活力单位的定义为：1mL酶液每分钟产生1μmoL的还原糖(以木糖计)为一个活力单位(IU)。2.3.7重组酶的酶学性质测定2.3.7.1最适作用温度在pH9、不同温度(40~80℃)条件下，测定重组酶酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活。2.3.7.2耐热性测定在pH9、90℃条件下保存2h，每0.5h取样测定酶活，以初始酶活为100%，计算残余酶活。2.3.7.3最适作用pH在温度为70℃、不同pH(pH6~11)条件下，测定重组酶酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活。2.3.7.4耐碱性测定在70℃、pH11条件下保存3h，每0.5h取样测定酶活，以初始酶活为100%，计算残余酶活。2.3.8重组木聚糖酶的漂白应用2.3.8.1重组木聚糖酶的预处理重组木聚糖酶的预处理实验在聚乙烯塑料袋内进行，称取20g绝干棉杆纸浆，调节浆浓为10%，并用氢氧化钠和盐酸将其pH调至9，按1~25IU/g干浆的加酶量加入调好pH的酶液，将酶液与纸浆在袋内混合均匀，置于70℃水浴锅内恒温处理3h，并每隔15min取出揉搓混合一次，使酶液与纸浆充分接触，以煮沸灭活后酶液作对照，处理方法一样。并且，选用与XynG1-1作用条件相近的商品木聚糖酶JT-G-M(pH5~9,50~70℃)作对比实验。2.3.8.2D0ED1化学漂白法方法参照文献[11][12]，预处理后的纸浆用布氏漏斗过滤，并用蒸馏水洗涤、过滤后，装入聚乙烯塑料袋中进行D0ED1三段化学漂白，其中，D0