心脏干细胞对心肌细胞凋亡的保护机制

中国组织工程研究第20卷第36期2016–09–02出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchSeptember2,2016Vol.20,No.36ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH5405·研究原著·高学东，男，1961年生，河南省南阳市人，汉族，2011年河南科技大学毕业，主治医师，主要从事心血管内科方面的工作。通讯作者：高学东，南阳市第三人民医院心血管内科，河南省南阳市473000中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)36-05405-07稿件接受：2016-08-01心脏干细胞对心肌细胞凋亡的保护机制高学东1，胡科2，魏虎3(南阳市第三人民医院，1心血管内科，3老年病科，河南省南阳市473000；2南阳市中心医院神经康复科，河南省南阳市473000)引用本文：高学东，胡科，魏虎.心脏干细胞对心肌细胞凋亡的保护机制[J].中国组织工程研究，2016，20(36):5405-5411.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.013ORCID:0000-0002-5644-5645(高学东)文章快速阅读：文题释义：心脏干细胞：可以细分为多个亚类，不同的心脏干细胞其表面标志物或来源不同，在心脏的发生、发育、修复与重塑过程中发挥重要作用。利用心脏干细胞修复受损的心脏，改善患者的心功能，是干细胞临床研究领域的热点。细胞凋亡：细胞凋亡属于一种细胞程序性死亡，在一定的条件下，细胞内一些相关基因被启动，便会激活相应的内源性DNA内切酶，导致细胞的主动性死亡。细胞凋亡涉及到不同的基因，包括促凋亡基因以及抗凋亡基因。摘要背景：心肌细胞凋亡会导致多种心脏疾病的出现，常规治疗大多无法获得理想的效果。心脏干细胞相关理论的出现，颠覆以往心肌细胞不可再生的观点，为各种心脏疾病的治疗提供了新思路。目的：探讨心脏干细胞在心肌细胞凋亡中的保护机制。方法：取5只新生大鼠进行心脏干细胞分离与培养，另取20只Wistar大鼠制备心肌梗死模型，然后随机分为2组，每组10只，分别设为观察组和对照组，建模后1d，分别予以心脏干细胞与培养液注射。治疗后14d，计算两组的心肌细胞凋亡指数，并检测两组心肌细胞凋亡相关蛋白表达情况。结果与结论：①细胞形态：连续培养3d，组织块呈现出完全铺展生长状态，组织块中爬出少量的类纤维细，磁珠分离后进行传代培养5d后，可观察到细胞重新聚集成团；②心肌细胞凋亡情况及相关蛋白表达：观察组的心肌细胞凋亡指数、Fas蛋白吸光度值和Fasl蛋白吸光度值均显著小于对照组(P0.05)，Bcl-2蛋白吸光度值显著大于对照组(P0.05)；③结果表明，通过对心肌梗死大鼠进行心脏干细胞移植治疗，可有效调节细胞凋亡相关蛋白的表达情况，抑制心肌细胞的凋亡。关键词：干细胞；移植；心脏干细胞；心肌梗死；心肌细胞；细胞凋亡；Fasl蛋白；Fas蛋白；Bcl-2蛋白；保护；大鼠；细胞分化；细胞移植主题词：干细胞；细胞凋亡；组织工程心脏干细胞与心肌细胞的凋亡心脏干细胞分离与培养免疫磁珠分选心肌细胞凋亡结局：通过对心肌梗死大鼠进行心脏干细胞移植治疗，可有效调节细胞凋亡相关蛋白的表达情况，抑制心肌细胞的凋亡。高学东，等.心脏干细胞对心肌细胞凋亡的保护机制P.O.Box10002,Shenyang110180’sHospitalofNanyang,Nanyang473000,HenanProvince,ChinaCorrespondingauthor:GaoXue-dong,DepartmentofCardiovascularMedicine,ThirdPeople’sHospitalofNanyang,Nanyang473000,HenanProvince,ChinaProtectivemechanismofcardiacstemcellsagainstmyocardialapoptosisGaoXue-dong1,HuKe2,WeiHu3(1DepartmentofCardiovascularMedicine,3DepartmentofGeriatrics,ThirdPeople’sHospitalofNanyang,Nanyang473000,HenanProvince,China;2DepartmentofNeurologicalRehabilitation,NanyangCentralHospital,Nanyang473000,HenanProvince,China)AbstractBACKGROUND:Myocardialapoptosiscanleadtomanykindsofheartdiseases,butmostoftheconventionaltreatmentscannotgetdesiredeffects.Theemergenceofcardiacstemcellrelatedtheorythatsubvertsthepreviousviewofmyocardialcellsprovidesanewideaforthetreatmentofavarietyofheartdiseases.OBJECTIVE:Toinvestigatetheprotectivemechanismofcardiacstemcellsinmyocardialapoptosis.METHODS:Cardiacstemcellswereisolatedfromfiveneonatalrats.Another20Wistarratswereselectedtomakemyocardialinfarctionmodels,andthenmodelratswereequivalentlyrandomizedintoobservationandcontrolgroups.Onedayaftermodeling,ratsineachgroupweregiveninjectionofcardiacstemcellsorculturesolution.Fourteendaysafterinjection,myocardialapoptosisindexwascalculatedandexpressionofapoptosis-relatedproteinswasdetectedinbothgroups.RESULTSANDCONCLUSION:Aftercontinuous3daysofculture,acompletelyspreadgrowthinthecardiactissueswasvisible,andasmallamountofcellssimilartofibrocytesclimbedoutfromthecardiactissuesample.Thesecellsisolatedusingmagneticbeadmethodweresub-culturedfor5days,andfoundtoberegroupedagain.Comparedwiththecontrolgroup,theapoptoticindex,FasandFaslexpressionweresignificantlylower(P0.05),andBcl-2expressionwassignificantlyhigherintheobservationgroup(P0.05).Allthesefindingsshowthatcardiacstemcelltransplantationcaneffectivelyregulatetheexpressionofapoptosis-relatedproteinsandinhibittheapoptosisofmyocardialcellsinratswithmyocardialinfarction.Subjectheadings:StemCells;Apoptosis;TissueEngineeringCitethisarticle:GaoXD,HuK,WeiH.Protectivemechanismofcardiacstemcellsagainstmyocardialapoptosis.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(36):5405-5411.0引言Introduction心肌梗死会导致心肌细胞凋亡的出现，受到疾病的影响，线粒体和肌浆网结构和功能异常、心肌细胞膜的完整性被破坏、细胞间信息传递和离子交换受影响，进而促进心肌细胞凋亡[1-2]。常规方法治疗心肌梗死大多无法获得理想的效果，而干细胞移植治疗则可通过分化形成心肌细胞，有效的发挥出修复效果[3-6]。心脏干细胞可以细分为多个亚类，不同的心脏干细胞其表面标志物或来源不同，在心脏的发生、发育、修复与重塑过程中发挥重要作用。利用心脏干细胞修复受损的心脏，改善患者的心功能，是干细胞临床研究领域的热点。以往Iaflamme等[7]和Hattori等[8]通过研究证实，在心肌组织中，存在一定的“心脏干细胞”。这些干细胞可以发生分化，分化为心肌细胞等。心肌梗死后心肌细胞发生凋亡，可作功的心肌细胞数量显著减少，导致心力衰竭的出现[9]。为此，在利用干细胞治疗心肌梗死的过程中，需要重视心肌细胞的凋亡问题，并对干细胞的细胞凋亡保护机制进行研究。但是，目前关于心脏干细胞在心肌细胞凋亡中的保护机制，相关的研究和报道较少。实验利用心脏干细胞对心肌梗死动物模型进行治疗，并通过对心肌细胞凋亡指数和心肌细胞凋亡相关蛋白表达情况的检测和比较，分析心脏干细胞在心肌细胞凋亡中的保护机制。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计随机对照动物实验。1.2时间及地点于2014年2月至2015年4月在南阳医学专科学校动物实验室完成。1.3材料新生雄性Wistar大鼠5只，体质量7-10g，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供，用于进行心脏干细胞分离与培养。健康雄性Wistar大鼠20只，用于进行动物实验，由北京隆安实验动物养殖中心提供，体质量约350g。动物均饲养于本校动物中心SPF环境，常规喂养。1.4实验方法1.4.1心脏干细胞分离与培养新生大鼠麻醉后处死，无菌环境下获得完整心脏组织，D-PBS液(Hyclone公司)进行洗涤，显微剪剪成小块(1.0-2.0mm3)，添加胰蛋白酶(Sigma公司)+胶原酶Ⅳ(Sigma公司)混合液进行消化，连续吹打30s，振荡后置于二氧化碳培养箱(Thermo高学东，等.心脏干细胞对心肌细胞凋亡的保护机制ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH5407公司)中进行培养[10]，5min后取出，添加等体积DMEM(上海显益化学科技有限公司)，含胎牛血清(Sigma公司)，再次机械吹打后静置。待大部分细胞下沉至管底后收集上清液，过滤后利用CEM，含胎牛血清、L-谷氨酰胺(美国PeproTech公司)、青霉素(江苏凯基生物技术股份有限公司)、2-巯基乙醇(北京旷博生物技术股份有限公司)、链霉素(江苏凯基生物技术股份有限公司)进行洗涤，洗涤结束转移至培养皿中，添加CEM2mL，置于培养箱中进行培养。连续培养4-6h后，轻轻摇晃培养皿，若组织块牢固贴敷在底部，则添加5mL培养液继续进行培养，培养三四天进行1次半量换液。进行常规传代培养，收集P3细胞用于随后的实验。1.4.2免疫磁珠分选将丙烯醛加入磁性微球悬液中，与兔抗大鼠c-kit多克隆抗体(碧云天