志贺氏菌检验.

志贺氏菌的检验一、流行病学简介•一种古老的肠道传染性腹泻。19世纪曾出现全世界菌痢的大流行。•1899年，日本人志贺氏首先发现菌痢是由痢疾杆菌引起。•第一次世界大战期间（1914-1918年），德国死于痢疾者约4万余人，并进一步证实痢疾杆菌是菌痢流行的病原。•细菌性痢疾历年来一直是我国夏秋季发病率最高的肠道传染病。•近年来报道非洲及中美洲流行的痢疾志贺菌病死率达5%-15%。•我国属发展中国家，人民的生活条件虽然在不断改善，但由于部分地区卫生知识普及不够，食品卫生管理、监督不力，使得志贺菌的感染在我国传染病中多年来一直处于较高的地位。•每年均有志贺菌感染暴发的报告，每次暴发的发病人数在数十人到上千人不等。多数由于食物和饮水污染引起。•1994年5月11日，江苏省无锡市发生一起26所小学的学生因课间餐食用豆奶导致1345人食物中毒的事故，后经调查是一起志贺菌和致病性大肠杆菌混合感染引起的食物中毒，此次爆发波及范围之大，发病人数之多，在我国历史上颇为少见。•志贺菌致病力强，少量细菌进入人体即可引起发病。是否发病，取决于细菌数量、致病力（粘附、侵袭力、毒素）和人体的抵抗力。•各种志贺菌都可以产生强烈的内毒素，是引起全身毒血症的主要因素。志贺菌还可产生外毒素（志贺毒素），具有神经毒、细胞毒和肠毒性作用，能引起更严重的临床表现如溶血性尿毒综合症等。二、生物学特性•（一）、形态与染色•革兰氏阴性短杆菌、无荚膜，无芽胞，无鞭毛••2~3um*0.5~0.7um（二）、培养特性1、需氧或兼氧性厌氧，最适温度37℃，PH7.2~7.42、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小的菌落3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。（三）、生化反应1、发酵葡萄糖，产酸不产气，除宋氏志贺氏菌外，均不发酵乳糖。2、不发酵侧金盏花醇、肌醇、水杨苷。3、不产生H2S，不分解尿素，V-P试验阴性，不能利用柠檬酸盐。4、甲基红阳性。（四）、抗原结构1、抗原构成：O抗原：群特异性抗原：A、B、C、DK抗原：除B群外，一般有K抗原2、志贺氏菌的分群与血清型志贺氏菌分为四群：A群（痢疾志贺氏菌）：1~10型B群（福氏志贺氏菌）：1~6型+X、Y两个变种，C群（鲍氏志贺氏菌）：1~15型D群（宋内氏志贺氏菌）：1个型三、志贺氏菌检验GB4789.5-20121.以原国标为基础，保持与原标准的连续性考虑基层单位方法的可操作性，对增菌步骤、培养条件尽可能简化；生化反应方面亦尽量沿用原标准中的方法2.与国际接轨的原则该标准的起草内容主要参考了国际标准组织ISO标准，部分参考采用了美国FDA、NMKL等标准3.与现有已颁布的新版国家标准协调统一参考了已颁布的2008版国标，在样品的前处理步骤，培养条件的选择，文字描述等方面尽量保持一致。GB/T4789.5-2003标准不足处1.采用GN增菌肉汤,37℃需氧培养,4小时后大肠菌的生长速度大大超过志贺氏菌,检测效果较差2.使用的分离平板SS对志贺1型有抑制3.检验方法与现行的其它国家的标准存在差异增菌：用GN增菌液使处于濒死状态的细菌恢复活力选择性平板分离培养：XLD+MAC/显色培养基生化试验：可采用API20E或VITEK2血清学鉴定：特异性诊断血清鉴定到种。志贺氏菌操作流程修改的内容增菌部分志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5μg/mL）原国标：GNISO：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5μg/mL）FDA：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5μg/mL和3μg/mL）NMKL：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5μg/mL）培养条件：41.5℃±1℃厌氧培养原国标：37℃需氧培养ISO：41.5℃厌氧培养FDA：42℃（除宋内其他志贺菌)和44℃（宋内）厌氧培养NMKL：42℃厌氧培养分离用平板原国标：HE或SS;MAC或EMBISO：MAC、XLD、HEFDA：MACNMKL：MAC、XLD、HE（一）增菌培养用志贺氏菌增菌液增菌,41.5℃±１℃，16h～20h厌氧培养。智能厌氧微需氧培养系统（二）分离培养•取增菌后的GN增菌液或志贺氏增菌肉汤分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或R&F志贺氏菌显色培养基平板上•于36℃1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态•若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察。菌落特征•MAC琼脂：无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐，直径2～3mm•XLD琼脂：粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐，直径1～2mmR&F志贺氏菌显色琼脂：白色，不透明、圆形、边缘不整齐，直径1mm～3mm，菌落周围琼脂颜色变为紫红色志显1宋内氏典型菌落XLD2福氏典型菌落志显XLDXLD3鲍氏典型菌落志显XLD4痢疾典型菌落志显5熟肉制品中宋内的分离效果R&F志显XLD志显6蔬菜制品中宋内分离效果XLD志显7鲍氏在生肉中的分离效果XLD8熟肉制品中福氏的分离效果志显（四）初步生化•选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖半固体、营养琼脂斜面，36℃1℃培养20h～24h，观察结果。•培养物中出现以下情况可以弃去a.在三糖铁琼脂斜面上蔓延生长b.发酵乳糖或蔗糖c.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的d.产气的e.产生硫化氢f.有动力的培养物初步生化:三糖铁（TSI）现象说明底层黄色葡萄糖阳性红色或不变色葡萄糖阴性黑色产H2S气泡产气斜面黄色乳糖和（或）蔗糖阳性红色或不变色乳糖和（或）蔗糖阴性志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。如图中2号管的反应.生化反应A群：痢疾志贺氏菌B群：福氏志贺氏菌C群：鲍氏志贺氏菌D群：宋内氏志贺氏菌ß-半乳糖苷酶－c－－c＋尿素－－－－赖氨酸脱羧酶－－－－鸟氨酸脱羧酶－－－a＋水杨苷－－－－七叶苷－－－－靛基质－/＋(＋)－/＋－甘露醇－＋b＋＋棉子糖－＋－＋甘油(＋)－(＋)d注：+阳性；-阴性；-/+多数阴性；+/-多数阳性；（+）迟缓阳性；d有不同生化型。a鲍氏13型为鸟氨酸阳性。b福氏4型和6型常见甘露醇阴性变种。c痢疾志贺1型和鲍氏13型为阳性。志贺氏菌属四个群的生化特征附加生化实验由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenicE.coli）、A-D（Alkalescens-Disparbiotypes碱性-异型）菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36℃培养24h～48h)。志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别见表3（五）生化鉴定•增加了API20E诊断试剂条和全自动细菌生化鉴定仪VITEK；（六）血清学鉴定1.抗原的准备志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。O抗原为糖脂蛋白复合物，可分为型特异性抗原和群特异性抗原。志贺氏菌分为4个群，48个血清型（包括亚型及变种）。K抗原在志贺菌属分类上无意义。菌体（0）抗原•1.型特异性抗原：化学组成为多糖，是光滑型菌株所含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常随之消失，根据所含的型抗原不同，可将志贺菌属分为A、B、C、D四个群及39个抗原型。•2.群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌体抗原的一种。特异性较低，主要存在于B群。根据所含的群抗原不同，可将一些菌型分为多种亚型。表面抗原（K抗原）在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原。不耐热，加热100℃1小时即被破坏。具有此种抗原的菌株，可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集。2.凝集反应3.血清学分型（选做项目）先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则再用相应各群多价血清分别试验。先用B群福氏志贺氏菌多价血清进行实验，如呈现凝集，再用其群和型因子血清分别检查，福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原鉴别见表4。如果B群多价血清不凝集，则用D群宋内氏志贺氏菌血清进行实验，如呈现凝集，则用其Ⅰ相和Ⅱ相血清检查；如果B、D群多价血清都不凝集，则用A群痢疾志贺氏菌多价血清及1～12各型因子血清检查，如果上述三种多价血清都不凝集，可用C群鲍氏志贺氏菌多价检查，并进一步用1～18各型因子血清检查。志贺氏菌的O抗原•人们原来的认识认为血清学试验是特异性的，但是志贺氏菌的O抗原和大肠埃希氏菌属关系密切，有半数的菌型与大肠埃希氏菌的某些O抗原完全相同。相同抗原菌属间存在血清交叉凝集反应。因此，生化试验对于属的鉴定是非常重要的。志贺氏菌属与大肠埃希氏菌的O抗原关系O抗原完全相同的：O抗原部分相同的:志贺氏菌属大肠埃希氏菌志贺氏菌属大肠埃希氏菌A2。112acA11,120.A3。124A2149A43588-51A3164.A558A488，159.A12(3341-55)152A6130B2b147abA7121B3a5444-80A838,23B4b135A10.144B5129A1129C1149A123C453B群1,2,13,16,17,19,62,69,73,3438-51C579C12,(50)C74838-69C287ab,,96C8143C385C11105abC4149C1432C676C15112abC9102C10105acC127C1328ac,98C1583C1647C17124C1829,可能结果报告•综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出志贺氏菌属。