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1乳酸菌在生产中的应用及其鉴定方法摘要：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。其在食品工业的应用具有悠久的历史，也是一种宝贵的微生物资源,和我们的健康息息相关。本文介绍了乳酸菌在实际生产中的应用，以及目前研究中发现适用于乳酸菌的鉴定技术。关键词：乳酸菌应用鉴定Abstract:Lacticacidbacteriarefertoaclassofnon-spore,grampositivebacteria,whichisthemainproductoflacticacid.Ithavebeenappliedinfoodindustryforalongtimeandarevaluableresourceofmicroorganisms,whichcloselyrelatedtoourhealth.Theapplicationoflacticacidbacteriainthepracticalproductionandtheidentificationtechnologyofthepresentresearchwereintroduced.Keywords:LacticacidbacteriaApplicationidentification1.前言乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，是一个广义范畴的概念而非正式的细菌分类学名称。乳酸菌可以分成18个属,共有200多种。乳酸菌的功能主要有:改善人体肠道功能,恢复人体肠道内菌群平衡,增强人体免疫能力,抑制腐败菌的生长,降低胆固醇,抗氧化,抗高血压,抗肿瘤,保藏食品,改善食品风味等。人们要利用乳酸菌，就需要了解它们的生物学特性，因此对乳酸菌进行快速、准确的分类与鉴定在微生物学和食品科学的研究中是必需的。目前，有根据细菌的表型性特征分类的传统方法，随着分子生物学的发展，出现了一些基因型方法用来鉴定乳酸菌。2.乳酸菌的应用2.1改善产品风味2乳酸菌利用可发酵性糖产生酸味柔和的乳酸同时,还产生丙酸、醋酸等有机酸,它们在赋予产品酸味的同时,还与乳酸发酵过程中产生的酸、醇、酮等物质相互作用,形成新的呈味物质,改善制品风味。因而经乳酸发酵的食品都具有其独特的风味[1]。乳酸菌的营养作用具体有:(1)发酵后产生的乳酸可提高钙、磷、铁的利用率,促进铁和VD的吸收;(2)乳酸菌中乳糖酶活力高,乳糖分解后的发酵乳更适合各种人群食用,所产生的半乳糖,可促进婴儿脑的迅速成长;(3)乳酸菌具有磷酸蛋白酶,能将乳中的α-酪蛋白分解成微细的奶酪脂肪肽和氨基酸等,从而提高了蛋白的消化吸收率;(4)发酵乳的脂肪呈微细的脂肪球,易于消化,且因分解了脂质,使非脂化的脂肪酸大大增加;(5)双歧杆菌能高水平地合成多种维生素(VB1、VB1、VB6、烟酸等),而且能分泌到胞外培养液中[2]。2.2改善胃肠道功能乳酸菌进入肠道后,即在肠内进行繁殖,抑制病原菌和有害人体健康的细菌的繁殖,从而起到预防感染,维持肠内菌群的平衡[3]。乳酸菌的代谢产物乳酸和醋酸对病原性微生物有拮抗作用。保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和乳酸乳杆菌所产生的H2O2也有明显的抑菌效果。乳酸菌还能分泌能抑制生病原菌的细菌素,如双岐杆菌、嗜酸乳杆菌和乳酸链球菌素等对多种革兰阳性菌,包括葡萄球菌、链球菌、微球菌、分支杆菌和斯特氏菌、乳杆菌均有抑制作用。2.3增强免疫力乳酸杆菌在调节免疫反应中发挥重要的作用。Chuang等[4]研究了热灭活乳酸菌对免疫功能的作用,调查了这些灭活乳酸菌刺激小鼠树突状细胞DCST细胞的反应。结果表明,这些灭活乳酸菌能刺激细胞增殖和白细胞介素IL-10,IL-12P70,干扰素IFN-γ的产生,并使T细胞TH分泌升高。目前,越来越多的研究使用乳酸菌作为疫苗抗原,杀菌剂和治疗粘膜运载工具。疫苗根据重组乳酸菌打破肠道的免疫耐受,以引发保护性免疫反应。Beatriz等[5]通过刺激肠上皮细胞,外周血单核细胞和单核细胞衍生的树突状细胞,测定细胞因子的产生来研究乳酸菌如何打破肠道免疫耐受。结果表明,脂化的OspA表达的植物乳杆菌促进肠上皮细胞分泌细胞因子IL-8,它通过Th1/Th2细胞介导的免疫打破肠道的免疫耐受。Sudo等[6]使用无菌(GF)小鼠口服耐受诱导IgE反应肠道菌群,也取得明显的效果。2.4降胆固醇3乳酸菌及其相关制品具有降低介质以及血清中胆固醇的能力这已被大量体内及体外实验所证实。Tahri等[7]研究了双歧杆菌消除胆固醇的作用机制。在静置细胞实验中,取出的胆固醇沉淀后在细胞中没有发现胆固醇,但是这种沉淀可以用磷酸盐缓冲液除去,看来这种沉淀是一个短暂的现象。在把双歧杆菌菌株培养在有放射性标记的游离或酯化的胆固醇的活细胞中,表现为能够吸收酯化的胆固醇。刘丽莉[8]等比较了6种乳酸菌体外降解胆固醇的能力,供试的6种乳酸菌菌株均可有效降解培养基中的胆固醇。陆小娜[9]等从新疆自制马奶酒中筛选出10株降胆固醇能力较强的菌种。2.5抗高血压和改善血脂Osuntoki等[10]发现食用高盐食品可使血压升高,通过从土著高盐发酵食品分离的嗜酸乳杆菌生产的发酵脱脂牛奶与高盐食品一起喂养雄性大鼠与空白对照组作对比来研究乳酸杆菌抗高血压效果。结果表明,喂食发酵脱脂牛奶和高盐食品后的小鼠没有显著变化,这说明分离的乳酸杆菌具有抗高血压的作用。来源于食物蛋白ACE抑制肽的降压肽可抑制(ACE)活性,有明显的降血压作用,这些多肽又是通过抑制血管紧张素转化酶的活性起降血压作用[11,12]。Flambard[13]发明了以瑞士乳杆菌为发酵菌株发酵动物奶蛋白或植物蛋白得到抗高血压肽的专利。此外，郑坚等[14]大量动物试验表明，乳酸菌发酵产生的有机酸、特殊酶系、细菌表面的成分以及乳酸在体内的代谢能改善血脂。有机酸中的醋酸盐、丙酸盐和乳酸盐可对脂肪的代谢进行调节,对降低血浆TC(总胆固醇)和LDL(甘油三脂),升高高密度脂蛋白HDL起着一定的作用。2.6生产Nisin乳酸链球菌素(Nisin)是由乳酸链球菌发酵而成的一种多肽类细菌素,是一种核糖体合成的肽,具有抗菌活性,Nisin在高酸和加热时都表现出较好的稳定性,其耐热性能优良,也是世界公认一种安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂[15,16]。由于Nisin是窄谱抗菌素,单独使用未必起到好的效果,并且Nisin具有一定的臭味,贮藏后对产品的气味有一些影响,通常将Nisin和其他几种保鲜剂联合使用会改善Nisin气味的影响,同时保鲜效果更好。3.乳酸菌的鉴定方法4由于乳酸菌的应用范围广泛，在生产和实验中对乳酸菌进行鉴定十分必要，有利于更有效的改良生产方式和针对性的研究。以下是实验中发展出的部分乳酸菌的鉴定方法。3.1经典方法经典方法又称常规检测法、表型特征鉴定法，主要依据细菌的菌落特征、菌体形态、生理生化特性、代谢产物等对乳酸菌进行鉴定。经典方法一般比较廉价而且在操作过程中不需要特殊的仪器，但是，相对来说比较耗时。在乳酸菌的工业应用中，有时并不需要把所有的乳酸菌都鉴定到种的水平[17,18]。韩春然等[19]人对从传统发酵面团中分离的菌种进行了形态观察，生理生化反应实验，初步鉴定出了4种乳酸菌。乳酸菌形态多样，并且容易受培养条件的影响，而且乳酸菌之间的生理生化特性极其相似，经典方法很难鉴定到属种水平，尤其在相同属种之间更加难以鉴定。对于生产中的乳酸菌研究，我们需要明确知道乳酸菌的种类，才能更好的研究不同菌种之间的相互关系，研究不同菌种对产品品质的影响，所以对样品中乳酸菌进行有效、准确的鉴定是研究这些问题的前提[20]。3.2分子生物学方法近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对乳酸菌进行基因鉴定的技术逐渐形成了一个体系。鉴定乳酸菌的分子生物学方法主要以聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）技术和核酸分子探针杂交为基础。3.1.1RAPD(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA)随机扩增多态性DNA，以制备的目的基因组DNA为模板，采用随机引物进行PCR扩增，获得多态性的DNA片段，再经过凝胶电泳分析后，进行未知菌株分类与鉴定。Manuel等[21]采用RAPD-PCR技术从传统的酸面团中分离出了典型的旧金山乳杆菌，并证实了旧金山乳杆菌的种内多样性。Meroth等[22]采用RAPD-PCR技术，使用引物M13V(5，_GTTTCCCCAGTCACGAC_3，）鉴定发酵酸面团中的乳酸菌。但Vuyst[23]等人证实M13V引物不能有效地区分旧金山乳杆菌和短乳杆菌。所以在具体的研究中通常要将多条引物进行比较和优化，挑选出分辨率较高、重复性相对较好的一条或几条引物。RAPD的分辨率高，并且不用知道目的DNA的任何序列信息，但是该方法的重复性比较差。53.1.2变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresisDGGE）1979年Fischer和Lennan[24]最先提出了用于检测DNA突变的一种电泳技术——变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE）技术。1993年Muzyer等[25]首次将DGGE技术应用于微生物研究，并证实这种方法用于微生物种属鉴定是十分有效的。007年，MilicaNikolic等人[26]通过PCR-DGGE的方法成功鉴定了当地自制山羊奶干酪中的乳酸菌。2006年，G.Spano等[27]运用DGGE技术成功分析了红葡萄酒中的酒类酒球菌（Oenococcusoeni）和植物乳杆菌（L.plantarum），并指出植物乳杆菌（L.plantarum）是发酵初期的优势菌种。Randazzo等[29]也报道了将DGGE分析与RT-PCR相结合的技术来研究干酪生产过程中微生物的构成和代谢活性。尽管DGGE电泳技术在研究群落动态和多样性方面存在很多优势，但是该技术无法给出代谢活性、细菌数量和基因表达水平方面的信息。因此必须与其它技术相结合才能弥补不足。3.1.316SrRNA序列分析原核生物含有3种类型rRNA：23S、16S和5SrRNA，它们分别含有2,900，1,540和120个核苷酸。5SrRNA虽然容易分析，但是核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；而23SrRNA含有的核苷酸几乎是16SrRNA的两倍，分析十分困难。通过大量的研究证明16SrRNA的全长约为1540bp，片段长度适中信息量较大且易于分析。近几年，随着测序技术的日益成熟以及测序的市场化，使得16SrRNA序列分析技术在乳酸菌鉴定中得到广泛应用。P.Parola等[30]应用16SrRNA序列分析技术，通过分析序列成功分离鉴定出了败血病人体内的干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）。2002年Booysen等[31]将分离自麦汁中的乳酸菌进行了分类研究，通过对其16SrRNA序列分析，成功的对实验菌株在亚种水平上进行了鉴定和区分。乌日娜等[32]结合传统生理生化鉴定方法与16SrRNA序列分析技术将实验室一株益生菌鉴定为干酪乳杆菌（L.casei）。2001年，Corseffi等[33]同样运用16SrDNA序列分析技术，成功的对分离自25个小麦酸面包中的317株乳酸菌在种的水平进行了分类鉴定。2000年TerenceR等[34]对猪排泄物中的一种能够产抗生素的菌株进行了DNA序列分析，在分析其16SrRNA序列的同时进一步对其4232bp质粒进行分析，最后以16SrRNA基因大于99%的同源性将其鉴定为罗伊乳杆菌（L.reuteri）。3.1.4随机扩增多态DNA技术（RAPD）6随机扩增多态性DNA（RandomAmplifiedPolymorphismDNA,RAPD）标记技术是由Williams[8]和Welsh同时发展起来的一种分类鉴定方法。它的基本原理是利用随机引物（一般为8-10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后应用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性，来完成其进