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山东省皮肤病医院性病实验室操作手册文件名称梅毒螺旋体检测标准操作规程编码页数实施日期制订人审核人批准人制订日期审核日期批准日期目的：规范的梅毒螺旋体检验操作，确保检测结果准确。适用范围：性病实验室工作人员责任人：实验操作者1、标本的采集与处理1.1标本采集的基本要求1.1.1操作应规范化。1.1.2所有标本都应当被视为具有传染性，医务人员应戴手套谨慎操作。1.2梅毒标本采集梅毒的实验室诊断主要有病原体检测和血清学检测方法，各期梅毒的检测方法及部位见下表。临床表现取材部位检查方法一期梅毒溃疡、淋巴结、血液暗视野检查、血清学检查二期梅毒皮损、淋巴结、血液暗视野检查、血清学检查潜伏梅毒血液血清学检查三期梅毒血液、脑脊液血清学检查神经梅毒血液、脑脊液血清学检查1.2.1血液1.2.1.1血清标本根据需要，用一次性真空采血针与促凝采血管抽取静脉血2-5ml，室温静置1-2小时（或37℃静置30分钟），待血液凝固、血块收缩后，3000r/min离心10-15分钟，分离新鲜血清，备用。也可采用保存于2-8℃或-20℃的血清。溶血、脂血或污染的标本可影响试验结果。1.2.1.2血浆标本根据需要，用一次性真空采血针与抗凝采血管抽取静脉血2-5ml，轻轻颠倒混匀8-10次，3000r/min离心10-15分钟，分离血浆，备用。血库血浆以及EDTA抗凝血浆同样可以用于梅毒血清学实验（一般仅用于RPR实验，），但易出现假阳性反应（需用血清复试），如用其他抗凝剂应首先评价后再用。1.2.1.3末梢全血消毒局部皮肤（成人和1岁以上儿童可选择手指或耳垂，1岁以下儿童采用足跟部）。一次性采血针刺破皮肤，用无菌棉签擦掉第一滴血。收集滴出的血液，立即用于检测。1.2.2皮损部位组织液1.2.2.1用于病原学检查用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物，钝刀/刮勺轻刮、挤压皮损部位，取渗出液与预先滴加在载玻片上的生理盐水混合后加盖玻片立即用于暗视野显微镜检测，或取渗出液直接涂片，用于镀银染色试验。1.2.2.2用于核酸检测用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物，钝刀/刮勺轻刮、挤压皮损部位，刮取渗出液，加入有DNA保存液（1ml/管）的标本管中，备用。1.2.3淋巴液无菌操作下穿刺腹股沟淋巴结，注入0.3ml无菌生理盐水并反复抽吸2-3次，取少量的淋巴液直接滴于载玻片上，加盖玻片后立即进行暗视野镜检或备用。1.2.4脑脊液操作由专业人员进行，一般用腰椎穿刺术获得。患者侧卧于硬板床，两手抱膝紧贴腹部，头向前胸屈曲，使躯干呈弓形，以髂后上棘连线与后正中线的交点为穿刺点，相当于第3-4腰椎棘突间隙，消毒处理后，用2%利多卡因自皮肤到椎间韧带作局部麻醉。术者用左手固定穿刺皮肤，右手持穿刺针以垂直背部方向缓缓刺入，针尖稍斜向头部，成人进针深度约4-6cm，儿童约2-4cm。当针头穿过韧带与硬脑膜时，有阻力突然消失落空感，此时可将针芯慢慢抽出，即可见脑脊液流出，至于合适的容器中，备用。1.3标本接收的标准1.3.1核对样品与运送单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒并做记录。1.3.2检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、脂血以及黄疸等情况。如果样品污染或者认为样品不能被接受，应将样品安全废弃。并将样品情况立即通知运送机构。1.3.3对不合要求的标本，可以拒绝接受。2、梅毒的实验室检查2.1梅毒螺旋体暗视野显微镜检查2.1.1原理梅毒螺旋体侵入人体后，在皮肤黏膜下增殖，并很快沿着淋巴管到达附近淋巴结，经过2-4周的潜伏期，在侵入部位发生炎症反应，称为硬下疳，数天到1周后，淋巴结肿大。二期梅毒是梅毒螺旋体由局部经淋巴结进入血液，在人体内大量播散后而出现的全身表现，一般发生在感染后的7-10周或硬下疳出现后6-24周，主要为皮肤黏膜损害，有扁平疣、黏膜斑和玫瑰斑疹等。患梅毒的孕妇可以通过胎盘使胎儿受染。研究证明，在妊娠期7周时，梅毒螺旋体即可通过胎盘。其梅毒患者硬下疳、淋巴结、皮肤黏膜损害以及孕妇羊水中均可检查到梅毒螺旋体。将标本置于暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上，可使梅毒螺旋体折射出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。2.1.2方法2.1.2.1仪器耗材：1)暗视野显微镜2)无菌纱布3)不锈钢刮刀4)灭菌棉拭子5)载玻片、盖玻片6)注射器，注射针头7)灭菌生理盐水2.1.2.2检测流程1)将待检标本制成生理盐水涂片，加盖玻片后立即备检。2)在预先调整好的暗视野显微镜的聚光器上加数滴浸油，轻轻调低聚光器，使之在载物台下方。3)将标本玻片置载物台上，上升聚光器，使浸油接触载玻片底面，避免浸油内有气泡。4)镜检：先低倍后高倍，寻找有特征形态和运动方式的梅毒螺旋体。2.1.3结果2.3.1.1结果判读：在暗视野显微镜下观察,发现有纤细、白色、有折光的螺旋状微生物，长6-20um,直径小于0.2um，有6-14个螺旋，具有旋转、蛇行及伸缩等特征性的运动方式，可判断为梅毒螺旋体。2.3.1.2结果报告：暗视野显微镜下若发现上述特征的梅毒螺旋体则报告阳性结果；未见到上述特征的梅毒螺旋体则报告阴性结果。2.1.4临床意义1)梅毒螺旋体暗视野显微镜检测阳性在临床上可确诊梅毒，特别是对于有皮肤黏膜损害和淋巴结病变的一、二期梅毒的诊断具有重要价值，且具有快速，方便，易操作等特点。2)若未能发现梅毒螺旋体，不能排除梅毒诊断。阴性结果原因可能为：标本中的微生物数量不足（单次的暗视野检测其敏感性低于50%）、病人已接受治疗、皮损已接近自然消退或取自非梅毒性皮损。3)无论暗视野显微镜检查的结果如何，都应进一步进行血清学检测。2.1.5注意事项1)取材前，应用无菌生理盐水清洁皮肤表面，取材时应注意无菌操作。2)应取到组织渗出液，尽量避免出血，以提高检出阳性率。3)取材后应立即置暗视野显微镜下观察，如搁置太久，梅毒螺旋体活动能力会下降，导致镜下难以观察到阳性结果。4)对口腔溃疡标本，在暗视野显微镜下如观察到梅毒螺旋体的特征性形态和运动方式，应与其他螺旋体相区别。2.2.甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）2.2.1原理梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主迅速对感染早期被损害的自身细胞以及梅毒螺旋体细胞表面所释放脂类物质做出免疫应答，在3-4周内可产生抗类脂抗原的抗体（亦称为反应素）。这种抗体在体外可与心磷脂、卵磷脂和胆固醇等组成的抗原（0.03%心磷脂、0.21%卵磷脂和0.90%胆固醇）发生抗原-抗体反应。心磷脂、卵磷脂和胆固醇都是醇溶性脂类，遇水形成胶体溶液。当含有反应素的梅毒血清与之混合时，即粘附在胶体颗粒的周围。经摇动、碰撞，形成抗原抗体复合物，出现凝集颗粒，即为阳性反应。甲苯胺红不加热血清试验即在抗原中加入甲苯胺红颗粒作为指示物，与待检血清（浆）中的反应素结合，形成肉眼可见的红色絮状物。血清不需灭活，肉眼可观察结果。2.2.2方法2.2.2.1仪器耗材：1)TRUST试剂盒2)水平旋转仪：要求旋转环状直径为2cm，转速为（100±2）r/min，并带有计时器和保湿盖）3)无菌生理盐水（0.9%）2.2.2.2检测流程：2.2.2.2.1定性试验1)试剂准备：检测前将试剂盒置室温预温30分钟2)加标本：吸取50μl血清（浆）置试验卡片圈中，并均匀地涂布在整个卡圈内。不能将标本溢出环圈外面。3)加抗原：将抗原轻轻摇匀，在每个标本圈中，用专用滴管针头垂直滴加1滴（60±1滴/ml，约17μl/滴）抗原,不需要手工混匀。4)反应：将卡片置水平旋转仪上，建议罩上保湿盖，（100±2）r/min旋转8分钟。5)从旋转仪中取出卡片后立即在亮光下用肉眼观察结果。用手轻微的旋转或倾斜卡片可有助于弱阳性和阴性标本。2.2.2.2.2定量实验1)实验卡片准备：在卡片中圈1到圈4中分别标上1:2，1：4，1：8，1：162)稀释液准备：在圈1到圈4中加入50μl生理盐水，勿将盐水液滴涂开。3)标本稀释：吸取50μl血清（浆）于圈1中，用移液器来回吸放5-6次已混合圈1中的生理盐水和标本，但要避免产生气泡。从圈1（1:2）中移取50μl到圈2（1：4）用上述同样方法混合后依次稀释至圈3（1：8）和圈4（1：16）。混旋后从圈4中弃去50μl。4)依次从圈4-圈1将不同稀释度的标本涂布整个圈内。5)加抗原等以下实验步骤同定性试验的2-4。6)如阳性反应滴度大于1;16,则继续稀释以测定最高稀释反应滴度。2.2.3结果2.2.3.1结果判读1)阳性反应：圆圈内出现中或大的红色絮状物，液体清亮；2)弱阳性反应：圆圈内出现小的红色絮状物，液体混浊；3)阴性反应：圆圈内仅见炭颗粒集中于中央一点或均匀分散。2.3.3.2结果报告1)定性试验：出现凝集反应报告阳性，不产生凝集反应报告阴性。2)定量实验：出现凝集反应的血清最高稀释倍数为抗体滴度，结果报告滴度为1：X，X依次为1、2、4等稀释倍数。2.2.4临床意义1)梅毒螺旋体一旦感染人体后产生抗类脂抗原的抗体，未经治疗可长期存在。经适当治疗后，抗体可以逐渐减少至转为阴性，早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后3个月，TRUST抗体滴度可下降2个稀释度，6个月可下降4个稀释度，一期梅毒一般约1年后可转为阴性，二期梅毒2年后可转为阴性。但晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍为阳性。2)TRUST定性试验结果可用于现症梅毒诊断。TURST定量试验结果可用于疗效观察和判愈。2.2.5注意事项1)生物学假阳性：非梅毒螺旋体抗原血清学试验采用的抗原为心磷脂、卵磷脂和胆固醇的混合物，所检测的抗心磷脂抗体易见于其他多种疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性疾病、结缔组织病、静脉吸毒者以及怀孕的妇女等。因此该类反应会出现假阳性反应。所以该类试验阳性标本需进一步采用梅毒螺旋体抗原血清学试验（如TPPA、ELISA）等复检，以排除生物学假阳性，确认是否为梅毒螺旋体感染。2)前带现象：只对早期梅毒患者进行非梅毒螺旋体抗原血清试验时，有时血清中存在高浓度的抗体，导致抗原抗体浓度不匹配，出现弱阳性、不典型或阴性反应的结果，此时需将血清稀释后再进行试验，可出现阳性结果。该现象称为前带现象。2.3梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）2.3.1原理梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）是用超声裂解梅毒螺旋体抗原致敏明胶粒子，致敏粒子与待检血清（浆）中的梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可见的颗粒凝集。2.3.2方法2.3.2.1仪器耗材：1)TPPA检测试剂盒2)移液器3)保湿盒2.3.2.2检测流程：1)试剂准备：试验前30分钟将待检标本和试剂从冰箱中取出，恢复至室温。2)加稀释液：每份样本作4孔，用移液器将血清稀释液滴入微量反应板第1孔（100μl），从第2孔-第4孔各滴25μl。3)样本稀释：用移液器取待检血清25μl置第1孔中，然后以2n的方式从第1孔稀释至第4孔。4)加对照液：用移液器在第3孔滴入25μl未致敏粒子；在第4孔滴入25μl致敏粒子。5)混合：以不会导致微量反应板内容物溅出的强度混合30秒钟。6)反应：加盖置湿盒内，于室温（15℃-30℃）下水平静置。2小时后观察并记录结果。附：重吸收试验对于未致敏粒子和致敏粒子均显示±以上凝集的样品，要按照下列程序在完成吸收操作的基础上进行再试验。1)取用定量的溶解液调制好的未致敏粒子0.95ml至小试管中。2)加入样品50μl混合，于室温（15℃-30℃）下放置20分钟以上。3)离心分离（2000rpm、5分钟），然后分别吸取上清液【吸收完毕的稀释样品（1：20）】50μl至反应板第3孔中，特别注意不要混入粒子。4)从第4孔以后，要预先各滴入25μl血清稀释液，从第3孔至最后一孔用移液器以2n的方式进行稀释。5)之后的步骤同上。2.3.3结果2.3.3.1结果判读首先观察未致敏粒子反应孔是否出现凝集（第3孔），判断试验有效性后，再根据致敏粒子与标本反应孔（第4孔）与致敏粒子是否产生1+～2+凝集反应凝集反应，判断结果。如未致敏粒子反应孔出现凝集（第3孔