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ABSTRACT:Therapeuticmonoclonalantibodiesandreceptor-fcfusionproteinshaveexhibitedexcellentefficacyinthetreatmentofcancerandautoimmunediseases.Theimmunogenicityofthesebiotherapeuticsmayimpacttheirsafetyandefficacyprofiledependingonthenatureoftheanti-drugantibodieselicited.Theexactmechanismofsuchimmunogenicityisunclearhoweveritisassociatedwithmanydifferentinherentandexternalconditions.Proteinaggregateshavebeenknowncontributingtoimmunogenicity.RationaldesignofmolecularsequenceandproductionprocessundertheguidanceofOualitybyDesign,includingthedevelopmentofhumanizedantibodyandfullyhumanantibody,andguantificationandcontrolofproteinaggregatesofthedrugproduct.willhelptoreduceoreliminateimmunogenicityandkeepthebalancebetweenefficacy,safetyandmanufacturabilityofsuchbiotherapeutics.KEYWORDS:MonoclonalAntibodyfusionProtein,ImmunogenicityAggregates药物的免疫原性，通常是指其诱发抗药物抗体反应的能力。这种反应的分子基础是蛋白质降解后产生肽段表位，如果这些表位被免疫系统识别为异源的，会诱导产生抗药物抗体。所有的外源性蛋白，包括用于治疗的蛋白质药物，都有引起抗体形成的可能性[2]。单抗类药物与其他蛋白质药物一样，有在患者体内引起免疫应答的潜力，诱发产生抗药抗体[3]，影响其有效性和安全性[4]。单抗类药物诱导产生的抗药抗体包括阻断单抗类药物与靶点结合的阻断抗体和与单抗类药物结合导致其功能丧失或被清除的中和抗体等。免疫原性有可能导致不同的临床后果。如果免疫原性诱发的抗抗体是中和抗体，则比非中和抗体更有可能导致药效降低。另外，免疫原性有可能引起温和或严重的不良反应。2引起免疫原性的原因单抗类药物免疫原性的发生机制尚没有明确的定论，可能与多种因素有关，包括患者的遗传背景、疾病类型、蛋白质类型、鼠源或人源、翻译后修饰、氧化或形成多聚体改变蛋白质的三维结构、给药途径、给药频率、疗程长短、药物的生产和贮存等。单克隆抗体技术发展的早期阶段所采用的杂交瘤技术只能生产鼠源抗体。因此，20世纪80年代进入临床试验的80%的单克隆抗体都是鼠源抗体[8]。鼠源抗体可能诱导产生人抗小鼠抗体或人大鼠抗体[9-10]，有可能阻断或清除鼠源抗体的作用，对其疗效和影像学形成负面影响[5]。抗体结构及分子生物学方面的进展使得可以将一些鼠源抗体改造为嵌合或人源化抗体。噬菌体展示文库和转基因动物技术的出现，使得不需要鼠源抗体作为起点，就可以产生人类抗体humanantibody。一般认为,依产生抗药抗体的可能性顺序而言,鼠源单抗最强,其次为嵌合抗体人源化抗体和人类抗体，因此，一般认为人类抗体或人源化抗体比鼠源抗体安全，因此。2000年左右进入临床试验的单克隆抗体中，只有7%是鼠源抗体[11]。不过,即使是人源化抗体或人类抗体,亦有可能诱发抗药物抗体的产生,人源化抗体,如抗CD3(teplizumab)[12-13]、抗CD52(阿伦单抗)以及阿达木单抗都曾诱导产生人抗人抗体[14]。蛋白质的天然修饰(例如翻译后的糖基化)或人为修饰(例如PEG化)等也可能改变单抗类药物的免疫原性。给药途径对免疫原性亦有影响。药物在肌内注射时的免疫原性可能会低于静注或皮下注射时的免疫原性。如果注射的组织内抗原呈递细胞如树突细胞的数量比较少，则免疫原性的风险会比较低。疾病的类型、患者的状态以及先前给药或协同给药,亦会影响免疫原性。例如,阿达木单抗在与甲氨蝶吟协同给药时，只在1%的类风湿性关节炎(RA)患者中表现出免疫原性，与其单独给药时12%的不良免疫应答形成鲜明的对比[15-16]。在单抗类药物的开发与生产中,还需要关注蛋白多聚体等因子对免疫原性的影响[21]，因为过往的研究表明,多聚体是导致免疫原性的重要因素之一。蛋白质多聚体是由天然或变性单体组成的多体构成的高分子量蛋白质。在不同的环境中，多聚体的形成有可能是可逆或不可逆的，可以是可溶性或不溶性的。在研究不依赖T辅助细胞的抗体应答时,DintzisRZ等[22]认为B细胞的刺激信号必须以足量的方式呈现，使得细胞表面表达的抗原受体，以超过一定数量的紧密相连的簇的形式构成一个免疫子(immunon)；构成这种刺激信号的多聚体分子量不能低于100kDa，且半抗原价数不得低于10。后续的研究工作表明，B细胞激活和抗体产生不仅仅依赖于分子量和半抗原价数，亦有赖于半抗原亲和性多聚体牢固性和结合动力学[23]。BachmannMF等[24]指出，疏松的多聚体可以诱导依赖T辅助细胞的抗体产生，而高度结构化的病毒壳体可以在没有T细胞辅助的情况下诱发抗体的产生,清楚地证明了高度结构化的蛋白质多聚体在诱发快速和有效的免疫应答方面的能力Rosen-bergAS[25]认为，处于高度阵列结构中的蛋白质抗原，例如那些在非还原多聚体中的蛋白质抗原可以在没有T细胞辅助的情况下诱导抗体的产生，多价蛋白质可以交联B细胞受体，通过Bt激酶激活B细胞进行增殖，将蛋白质导向型主要组织相容性复合体（MHC）的装载腔室，有效地诱发T细胞辅助的抗体应答。以上研究工作表明，高分子量的聚集抗原阵列可以高效地诱导不依赖T细胞辅助的抗体应答而结构松散的聚集抗原可能需要T细胞辅助才能产生免疫应答。总之，一般认为形成多聚体的，因此，为降低蛋白质药物包括单抗类药物的免疫原性有必要确保蛋白质天然构象的稳定性避免高分子量多聚体的形成。鉴于蛋白质多聚体是增强免疫原性的重要因素之一，需要在生产过程中间产品和成品中监测与控制多聚体含量，一般通过分子尺寸排阻高效液相色谱法SEC-HPLC检测产品中的蛋白质多聚体该方法具有灵敏度高的特点但是也有缺陷例如某些高分子量的多聚体可能不能通过因此应采取与SEC-HPLC正交的方法予以补充例如光学，荧光和电子显微镜术，浊度法，质谱法，电泳法，UV-VIS，光谱法，红外光谱法荧光光谱法，圆二色谱法，CD，核磁共振等。人源化技术，即将鼠源单抗的恒定区及可变区的框架区用人类序列替换，可以实现鼠源单抗的人源化改造，从而显著地降低免疫原性[11，32]。而转基因小鼠和噬菌体展示等技术，使得可以选择与人类种系序列高度同源的抗体序列，以降低免疫原性的风险。即便如此，局部人源化的单抗，甚至完全人源化单抗仍然有免疫原性风险[32]。降低免疫原性的另一种思路是“去免疫化”，即通过去除T细胞表位，避免与HLA结合。这种思路与肿瘤细胞或其他病原体逃避宿主免疫系统攻击的方式相类似。如前所述，蛋白质多聚体对免疫原性有重要影响。多聚体在单抗类药物的生产、贮存、运输和向患者交付的过程中都有可能形成，因为这些过程中的各种物理和化学因子都有可能诱导多聚体形成，包括温度波动、光照、摇晃、表面效应pH调整等[33-34]。形成的多聚体直径从几纳米到几毫米不等。如果形成多聚体的根源没有消除，则除菌过滤不会起到去除多聚体的作用，因为多聚体会在除菌过滤后再次形成[35]。因此，可在产品和工艺开发阶段，按照QbD的原则，深入研究和开发单抗类药物的细胞培养、纯化、制剂工艺条件，包装和贮存条件，避免或尽量减少蛋白质多聚体的形成。[1]ClarkeJB.Mechanismsofadversedrugreactionstobiologics.HandbExpPharmacol[J].2010(196):453-474.[2]SchellekensH.Immunogenicityoftherapeuticproteins:clinicalimplicationsandfutureprospects[J].ClinTher,2002,24(11):1720-1740.[3]HanselTT,KropshoferH,SingerT,etal.Thesafetyandsideeffectsofmonoclonalantibodies[J].NatRevDrugDiscov,2010,9(4):325-338.[4]ShankarG,ShoresE,WagnerC,etal.Scientificandregulatoryconsiderationsontheimmunogenicityofbiologics[J].TrendsBiotechnol,2006,24(6):274-280.[5]Kuus-ReichelK,GrauerLS,KaravodinLM,etal.Willimmuno-genicitylimittheuse,efficacy,andfuturedevelopmentofthera-peuticmonoclonalantibodies?[J].ClinDiagnLabImmunol,1994,1(4):365-372.[6]NormanDJ,ChatenoudL,CohenD,etal.ConsensusstatementregardingOKT3-inducedcytokinereleasesyndromeandhumananti-mouseantibodies[J].TransplantProca1993,25(2Suppl1):89-92.[7]StasP,LastersI.Strategiesforpreclinicalimmunogenicityassess-mentofproteintherapeutics[J].IDrugs,2009,12(3):169-173.[8]NelsonAL,DhimoleaE,ReichertJM.Developmenttrendsforhumanmonoclonaltherapeutics[J].NatRevDrugDiscov,2010,9(10):767-774.[9]PrestaLG.Molecularengineeringanddesignoftherapeuticanti-bodies[J].CurrOpinImmunol,2008,20(4):460-470.[10]WaldmannH,HaleG.CAMPATH:fromconcepttoclinic[J].PhilosTransRSocLondBBiolSci,2005,360(1461):1707-1711.[11]HwangWY,FooteJ.Immunogenicityofengineeredantibodies[J].Methods,2005,36(1):3-10.[12]HeroldKC,GitelmanSE,MasharaniU,etal.Asinglecourseofanti-CD3monoclonalantibodyhOK-T3gamma1(Ala-Ala)resultsinimprovementinC-peptideresponsesandclinicalpa-rametersforatleast2yearsafteronsetoftype1diabetes[J].Di-abetes,2005,54(6):1763-1769.[13]XuD,AlegreML