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附件6：湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目结题报告项目名称：郴州市旅游区蜱虫伯氏疏螺旋体及立克次体混合感染调查研究项目编号：2011-362学生姓名：朱文珍所在学校和院系：湘南学院医学基础医学部项目实施时间：2011年6月指导教师:阳帆联系电话:15873507661填表日期：2013年3月21日湖南省教育厅2011年制一、基本情况项目名称郴州市旅游区蜱虫伯氏疏螺旋体及立克次体混合感染调查研究立项时间2011.6完成时间2013.5项目主要研究人员序号姓名学号专业班级所在院（系）项目中的分工1朱文珍200915170224临床医学09级2班临床医学系项目主持、协调及实施2曾辉200915170822临床医学09级8班临床医学系负责开题报告设计、制作PPT3段志轲200915170203临床医学09级2班临床医学系会议记录查阅文献4刘杰斌200915170214临床医学09级2班临床医学系收集、分析数据5刘杰娇200915170222临床医学09级2班临床医学系收集、分析数据二、研究成果简介项目研究的目的、意义；研究成果的主要内容、重要观点或对策建议；成果的创新特色、实践意义和社会影响；研究成果和研究方法的特色。限定在2000字以内。（一）研究的目的与意义：通过鉴定湘南地区主要旅游区蜱虫种类；调查并分析蜱虫体内伯氏疏螺旋体感染、斑点热群立克次体感染、混合感染情况。以期为本地区旅游业发展在疾病防治方面提供可靠依据。本研究首次在湘南主要旅游地区调查伯氏疏螺旋体与斑点热群立克次体混合感染情况。（二）研究内容：1.本地区蜱虫种类鉴定；2.蜱虫体内伯氏疏螺旋体感染情况调查；3.斑点热群立克次体感染情况调查；4.混合感染情况调查；（三）成果的创新特色、实践意义和社会影响1．成果的创新点本研究首次在湘南主要旅游地区调查伯氏疏螺旋体与斑点热群立克次体混合感染情况。2．实践意义和社会影响通过这次实验本，不仅我们的动手能力以及实践能力得到了提高，更多的是我们学到了认真仔细、坚持不懈，善于思考总结的可贵精神以及直接面对困难挫折的勇气，培养了我们严谨的科学实验观。同时实验结果为本地区伯氏疏螺旋体与斑点热群立克次体混合感染的治疗、预防提供证据，为本地区旅游业发展在疾病防治方面提供可靠依据。三、项目研究总结报告预定计划执行情况，项目研究和实践情况，研究工作中取得的主要成绩和收获，研究工作有哪些不足，有哪些问题尚需深入研究，研究工作中的困难、问题和建议。（字数不限，可加页面）（一）预定计划执行情况按照预定计划进行了实施。较好地完成了原定研究内容。1.采用布旗法及家畜体表抓取法采集郴州地区蜱虫；2.进行分类鉴定后运用巢式PCR法检测蜱标本中的伯氏疏螺旋体、斑点热立克次体的感染情况及混合感染的情况。3.采用SPSS13.0软件进行测序后的统计分析。（二）项目研究和实践情况1.标本采集及其生活环境：郴州位于湖南省东南部，地处南岭山脉中段与罗霄山脉南段交汇地带，东界江西省赣州市，南邻广东省韶关市、清远市。地理坐标东经112°13ˊ-114°14ˊ，北纬24°53ˊ-26°50ˊ，气候属于亚热带湿润气候。2011年5月-2012年6月，在湖南省郴州市莽山、苏仙岭、王仙岭、樟树岭等风景旅游区2组人员同时采用布旗法、当地家畜体表直接抓取法收集蜱虫标本，鉴定分类后保存待用。2.蜱标本中病原体DNA的提取：采用煮沸法提取蜱标本中病原体DNA。将采集的蜱标本先用75%的酒精浸泡15min，无菌滤纸吸干后用生理盐水漂洗3次，无菌滤纸吸干体表水分后放EP管，研碎。离心管置100°C水中煮12min，移至离心机中，5000转离心12min，吸取上清液后保存备用。3.伯氏疏螺旋体及斑点热立克次体PCR鉴定：1）引物合成：合成伯氏疏螺旋体、斑点热立克次体引物序列及位置如下表（1），引物均为宝生物工程（大连)有限公司合成。表（1）检验病原体的引物体系病原体引物名称序列长度(bp)位置(bp)伯氏疏螺旋体23S3(+)5-CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC-3213084~310423Sa(-)5-TAAGCTGACTAATACTAATTACCC-3243495~347223S6(+)5-TCCTAGGCATTCACCATA-3183105~312223S5(-)5-CTGCGAGTTCGCGGGAGA-3183358~3341斑点热立克次体ompA19070p(+)5-ATGGCGAATATTTCTCCAAAA-32170~90ompA190701(-)5-GTTCCGTTAATGGCAGCATCT-321701~6812）PCR反应体系：①伯氏疏螺旋体:20μl反应体系：10×TE缓冲液2ul,上、下游引物（12.5μmol/l）各0.4ul，dNTP（10mmol/l）0.4ul,TaqDNA聚合酶(2.5u/ul)1ul，模板2ul。②斑点热群立克次体：20μl反应体系：10×TE缓冲液2ul,上下游引物（12.5μmol/l）各0.4ul，dNTP（10mmol/l）0.4ul,TaqDNA聚合酶(2.5u/ul)1ul，模板2ul。PCR扩增条件见表（2）表（2）PCR反应体系引物预变性（°C，s)变性（°C，s)退火（°C，s)延伸（°C，s)循环数最后延伸（°C，s)扩增片段(bp)23s3/23sa96.294.3055.3072.403072,741223s6/23s596.294.3059.3072.403072.7254ompA95.394.1554.3070.303570.76324.测序及序列分析将PCR阳性产物送北京三博远志有限公司测序，双向测通并应用NCBI网站中的BLAST操作平台，将所测序列与GenBank中注册的5S~23SrRNA间隔区和的RrompA序列进行同源性比较，选择代表性的参照菌株，用SSPS13.0软件进行数据分析。（三）研究工作中取得的主要成绩和收获1、研究工作中取得的主要成绩通过实验我们取得了以下结果：此次共采集到蜱标本336只，经分类鉴定其中98只为硬蜱属的全沟硬蜱，占总数的29.2%；剩余238只均为革蜱属的林革森蜱，占总数的70.8%。森林革蜱为郴州地区的优势蜱种，各地采集的蜱标本相当。1）郴州地区蜱中自然感染伯氏疏螺旋体的检测结果及序列分析对336只蜱虫自然感染伯氏疏螺旋体进行了检测，其中全沟硬蜱感染率为28.2%，森林革蜱感染率为32.4%。2）郴州地区蜱中自然感染斑点热群立克次体的检测结果及序列分析对336只蜱虫自然感染斑点热群立克次体进行了检测，其中全沟硬蜱感染率为6.5%，森林革蜱感染率为8.4%。3）郴州地区蜱中伯氏疏螺旋体与斑点热群立克次体混合感染的检测结果此次检测结果全沟硬蜱中伯氏疏螺旋体与斑点热群立克次体混合感染率为4.8%;森林革蜱中伯氏疏螺旋体及斑点热群立克次体的混合感染率为7.2%2、收获与体会1）团队协作是首要保障由于项目涉及的方面较为广泛，不仅有流行病学调查，还需要进行分子生物学实验等，同时研究时间周期比较长，那么这就要求在保证我们繁重的本科课程的学习之外，还必须利用大量的课余时间来进行实验。因此我们利用了寒假及暑假的大量假期时间来进行了共同的学习和实验。在这个过程中，团队合作得以体现，因为实验的连贯性以及相通性，我们需要每个组员都学会共享自己的学习资源，这样才能保证团队工作的进度不会落后。在实验期间，按照指定的计划进行实验，保证每个实验的按时性，由于实验是一项不可预测的工作，所以我们经常在一起讨论实验中遇到的问题，通过与导师的商讨，查阅文献资料，一起解决问题，改进方法，以此解决更多的问题。实验的过程中，实验的连贯性也要求我们组员之间相互指导，相互帮助，共同面对困难，克服困难。在学会实验的同时，也学会了一个科研实验是需要大家共同努力才能得以完成的。2）学会分析问题以及记录分析问题文档在实验初期，我们就面临了大量从前只是表浅学习的内容，而要完成实验，就要求我们更加深入，更加透彻的把每一个实验都进行系统的学习和掌握。在解决问题的过程中，我们学会了遇问题，知问题，解问题，总结问题，再改进等等。面对问题我们不再茫然，而是冷静的去分析，解决。锻炼了自己的科研能力。3）常怀感恩之心非常感谢学校给我们这个展示自我的机会。我们在这次实验过程中，初步学到了很多在本科课本上学不到，看不到的实验方法，结果等，让我们了解到所学习的知识是通过大量的科研工作和总结得来的。激励我们必须努力学习，站在巨人的肩上，不断前行。也学会了做人，做事的严谨，真诚态度。不论是对将来学习、工作以及生活，都会有很大帮助。本课题小组已发表论文：《郴州市旅游区蜱虫伯氏疏螺旋体及立克次体混合感染调查研究》，已投《中外健康文摘》，并已被录用。四、经费使用情况经费合计20000元，其中，学校配套资助10000元，学院（所）配套资助0元，其他经费0元。经费支出情况：序号支出科目金额(万元)备注（注明经费支出时间和用途）1科研业务费0.80国内会议/调研/资料/文献/网络/打字复印/版面费/评奖申报费2实验材料费0.90实验动物/实验试剂及耗材等3协作费0.20引物合成、测序费等4劳务费0.10研究人员加班费合计2.00五、指导教师及学院（系）审核意见项目指导教师对结题的意见，包括对项目研究工作和研究成果的评价等。以朱文珍同学为主的课题小组能够按计划开展本课题的研究工作，完成了从文献查阅、方案设计、实验准备、实验摸索的各个科研环节的工作。能在老师指导下理解实验现象，发现问题，努力寻找方法解决问题，对科研工作有新的体会并取得了可喜的成绩，达到了预期目标。在国内学术期刊发表论文1篇.同意结题。负责人签章：年月日项目主持人所在学院（系）对结题的意见，包括对项目研究工作和研究成果的评价等负责人签章：年月日六、学校结题审核意见学校对项目研究的任务、目标、方法和研究成果水平等进行评价，是否结题。年月日