生物素亲和素

概述生物素－亲合素系统（Biotin-Avidin—System，BAS）是70年代末发展起来的一种以生物素和亲合素的特异结合反应为原理的新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于分子生物学各领域之中。1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力的特点，建立了标记亲合素和生物素法与桥联亲合素—生物素技术。1981年Hsu首次报告了改进的亲合素—生物素—过氧化酶复合物法（ABC法）。近年大量研究证实，生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、核酸等。生物素—亲合素已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。一)生物素二)活化生物素与标记三)亲和素及链霉亲和素四)亲和素及链霉亲和素的标记五)生物素-亲和素系统六)生物素-亲和素系统的应用功能：可与多种标记物如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、核酸等结合。这些生物活性物质在生物素化后，其活性不会受到显著影响。如抗体分子经生物素化后，其结合抗原的活性不受影响。同样多种酶结生物素化，其催化力也保持不变或稍有降低。概念：生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。与亲合素结合与抗体或酶结合分子式：C10H16O3N2S分子量：244.31等电点：PH=3.5溶解特性：难溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)两个环状结构：I环（咪唑酮环）为与亲和素结合的主要部位；II环（噻吩环）为结合抗体和其它生物大分子的部位，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构结构特点：咪唑酮环/四氢噻吩环结合亲和素侧链末端羧基结合蛋白质特性：羧基需经活化修饰才能结合蛋白质（羧基活化的生物素称活化生物素或生物素衍生物）I咪唑酮环Ⅱ噻吩环羧基生物素的特点：1）生物素分子较小，与蛋白质结合后，由于大分子蛋白质的空间位阻效应，可影响生物素与亲和素间的结合；2）生物素只能依靠肽键与蛋白质上的氨基结合。活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻效应，又可扩大其结合的对象。生物素侧链的末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)活化生物素易与抗原、抗体酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物标记蛋白质氨基的活化生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）长臂活化生物素（BCNHS）标记蛋白质醛基的活化生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）标记蛋白质巯基的活化生物素3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）标记核酸的活化生物素光生物素、BNHS和BHZ生物素脱氧核苷三磷酸适合于Ab、酶、中性或偏碱性Ag、DNA、蛋白的标记长臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的距离增加，更易发挥生物素的活性作用。如何减小空间位阻生物素分子量小，当与抗体或酶形成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的空间位阻效应，可对生物素与亲和素的结合以及BAS的应用效果造成干扰。如何减小空间位阻标记特点：BNHS和BCNGS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基结合达到标记的目的BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物主要用于标记偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接后，再与无水肼反应而成。除醛基外，BCHZ还可标记氨基标记特点：BHZ与蛋白质中的醛基结合而标记马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素光生物素(photobiotin)光敏物质侧链上连接的芳香基叠氮物基团，经光照后，变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合，形成B-核酸探针，用于DNA或RNA的标记。目前常用光生物素和生物素化dUTP作为标记核酸的活化生物素。N3NO2NH(CH2)3N(CH2)3CH3NHC(CH2)4SNHNHO生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法掺入到双链DNA中。BNHS和BHZ可直接标记核酸，但对碱基配对有影响（影响氢键的形成）特性：活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性（是BAS多级放大作用的物质基础）；BNHS多标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质,BHZ则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后，活性降低；注意事项：选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；控制生物素：蛋白质比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；使用交联臂减少空间阻力概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖蛋白，可由蛋清中提取。亲和素可以和4个生物素分子亲密结合，这虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。且由于多种生物活性物质在生物素化后，其活性不会受到显著影响，故而二者在结合反应时具有的多级放大作用。主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已深入研究并得到广泛应用。结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它是与生物素结合的基团。特性：每个亚基都可结合1个生物素分子，即1个亲和素分子可结合4个生物素分子。分子量：68000亲和常数：1015/mol缺点：由于是碱性蛋白（PI=10），且含糖基，与聚苯乙烯的非特异性吸附较高，会导致本底增大，降低检测灵敏度。溶于水：C=5mg/ml；比活性：A≥12u/mgP概念：是从链球菌属的菌培养液中提取的一种蛋白质。优点：为弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基，因此与聚苯乙稀的非特异性吸附远低于亲和素，因此应用广泛。结构：由4个相同的肽链组成，甘氨酸和丙氨酸含量较大。特性：1个亲和素分子可结合4个生物素分子。分子量：65000亲和常数：1015/mol结构四亚基糖蛋白四肽链蛋白无糖基PI10.56结合位色氨酸色氨酸生物素44Ka10151015活性13～15U15～18U亲合素（AV）链霉亲合素(SA)SA表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合远低于AV，因此目前以SA标记的酶结合物更为常用。亲合素(Avidin,AV)亲和素（Avidin)耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素结合后稳定性更好。每个亲和素能结合四个分子的生物素生物素（Biotin,B）亲和素的标记：HRP(过氧化酶)的标记标记物：小分子物质：示踪物125I、胶体金、异硫氰酸荧光素(FITC)、化学发光物大分子物质：如酶、抗原、抗体、铁蛋白改良过碘酸钠法戊二醛法链霉亲和素的标记方法：过碘酸钠法HRP+NaIO4+SA透析+KBH4沉淀OOOOOONaIO4+NH2AvidinOOOHOHNAvidinH2OOOOHOOONAvidinNAvdinNaBH4Schiff碱酶-五炭糖环酶－NH2亲和素－NH2＋(CH2)3CHOCHO(CH2)3CHN酶CHN亲和素OOOOOONaIO4OOOHOH+NH2SAvidinNSAvidinH2OOOOHOOONSAvidinNAvdinKBH4Schiff碱酶-五炭糖环生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强生物素与亲合素各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献灵敏度高:生物素标记蛋白具有多价性，且标记后的抗原/抗体生物活性不变，每个亲合素有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上，因此，BAS具有多级放大作用，反应的灵敏度高。稳定性高和特异性强：AV/SA与生物素结合的亲和常数比抗原-抗体反应至少高1万倍，二者的结合呈高度专一性和不可逆性，且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶、有机溶剂以及反应试剂的高度稀释均不影响其结合。因此，BAS稳定性高，特异性强。适用性广泛：BAS的多级放大作用，以及既可偶联生物大分子，又可连接标记材料，使BAS不仅用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。其他：可制成通用试剂（如生物素化二抗等）；反应试剂可高度稀释，特别是与一抗偶联使用可大幅减少一抗用量，降低实验成本；实验所需时间不长。可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹心法、间接法、竞争法等，在此基础上引入A-B系统。BAB法：BA法：ABC法：BAB法（亲和素-标记生物素法）：特点：以游离亲和素为桥臂，分别连接生物素化抗原（或抗体）和标记生物素（如酶标生物素）Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E+A+A亲和素-标记生物素法（BAB法）：先使抗原与生物素（B）化的抗体结合，再以游离亲合素(A)将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。亲合素(A)生物素化的抗体酶标生物素底物BA法（标记亲和素-生物素法）特点：以标记亲和素/标记链霉亲和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的游离亲和素（A），省却了加标记生物素（B-E）的步骤。+A-E标记亲和素-生物素法（BA法）：以标记亲和素/标记链霉亲和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的亲和素（A），省却了加标记生物素（B-E）的步骤。A-E+A-EAg+B·AbAg-Ab·BA·E/SA·EAg-Ab·B-A/SA·EABC系统（亲和素-生物素-过氧化物酶复合物系统）特点:将BAB法中的A（亲和素）先与B-E（酶标生物素）结合，制备成复合物ABC（亲和素-生物素-过氧化酶复合物），网络了大量酶分子，使该法的检测灵敏。度显著提高。ABC法⑴A+B·EA-B·E----ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC（1）ABC复合物的制备：生物素生物素-PO过氧化物酶（PO）亲和素亲和素-生物素-POABC法中过氧化物酶常用辣根过氧化物酶，通过它与底物的显色程度来判断抗体或抗原含量并对其进行标记。此法广泛应用于免疫组织化学及酶联免疫吸附等技术中生物素化的二抗一抗过氧化物酶底物显色的反应混合物固定化抗原生（2）ABC法反应原理+ABCAb-Ag-Ab-B+ABCAb-Ag-Ab-B-ABC预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素（或链霉亲和素）-生物素-过氧化物酶复合物（ABC或SABC）。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC（或SABC）复合物中未饱和的亲和素（或链霉亲和素）结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原-抗体反应体系与ABC（或SABC）标记体系连成一体进行检测+ABC法原理示意图BABBAABCBAB与ABC成员相同，反应顺序不同此外，按待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，BAS分为直接法和间接法。方法反应层次直接法BAAg-(Ab-B)-A*BABAg-(Ab-B)-A-B*ABCAg-(Ab-B)-A-B*C间接法BAAg-Ab1-(Ab2-B)-A*BABAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*ABCAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*CBAS实验方法及反应层次BAS在酶免疫技术中的应用BAS在荧光免疫技术中的应用BAS在放射免疫技术中的应用BAS在分子生物学中的应用BAS在ELISA中的应用：生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定BAB-ELISA夹心法测抗原的原理：用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗体，与已与固相抗体结合的抗原抗体复合物结合，然后连接亲和素及酶标生物素，从而使反应信号放大，提高