恶性肿瘤干细胞标记物CD34在鼻咽癌细胞系的表达

中国组织工程研究第20卷第23期2016–06–03出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJune3,2016Vol.20,No.23P.O.Box10002,Shenyang110180·研究原著·张军红，女，1974年生，河北省邢台市人，汉族，2009年河北医科大学毕业，主治医师，主要从事癌症的发病机制和临床病理相关性研究。中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)23-03374-06稿件接受：2015-04-13恶性肿瘤干细胞标记物CD34在鼻咽癌细胞系的表达张军红1，李青2，王春华3，吴秀云3，卢新阁3，王莉菲4，杨蕾蕾1，王秋红5(河北省眼科医院，河北省眼科研究所，1病理科，3耳鼻喉科，4河北省眼科学重点实验室，5检验科，河北省邢台市054000；2贵阳医学院附属医院骨科，贵州省贵阳市550004)引用本文：张军红，李青，王春华，吴秀云，卢新阁，王莉菲，杨蕾蕾，王秋红.恶性肿瘤干细胞标记物CD34在鼻咽癌细胞系的表达[J].中国组织工程研究，2016，20(23):3374-3379.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.004ORCID:0000-0002-5551-9315(张军红)文章快速阅读：文题释义：肿瘤干细胞假说：是近年提出的肿瘤发生的新理论，目前已经在白血病、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、脑癌等肿瘤组织中分离出肿瘤干细胞。近年来的研究结果支持肿瘤干细胞具有转移和抗放化疗的特点。CD34分子：最初发现是特异性表达在人类造血干细胞表面高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白。随着对CD34的深入研究，发现CD34特异性表达在白血病、结直肠、脑瘤和头颈癌等肿瘤干细胞表面，可作为表面标志分子分离肿瘤干细胞。对CD34在广度和深度的深入研究，可能对于癌症的诊断和治疗有重要意义。摘要背景：在多种肿瘤中已证实CD34与肿瘤的发生、发展、复发、转移、耐药密切相关，但是CD34与鼻咽癌的关系目前还知之甚少。目的：分选鼻咽癌细胞株中CD34+与CD34-细胞的增殖和迁移能力。方法：利用流式细胞术检测CD34在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2中的表达，根据细胞表面标志物分选出CD34+与CD34-细胞，进行纯度鉴定；通过体外MTT法、平板克隆形成实验以及划痕实验分析CD34+细胞与CD34-细胞增殖和迁移能力。结果与结论：①4种鼻咽癌细胞株中CD34表达均恒定在0.1%-0.2%，且CD34水平与细胞的生长密度关系密切；②分选的CD34+细胞群中，CD34+细胞例能达到98%以上，在CD34-细胞群中未能检测到CD34+细胞；③CD34+细胞在第1，3，5，7天增殖速度显著高于CD34-细胞(P0.05)；④CD34+细胞克隆形成率显著高于CD34-细胞(P0.05)；⑤CD34+细胞向划痕区迁移的细胞明显多于CD34-细胞(P0.05)；⑥结果提示，CD34+细胞体外培养具有更高的增殖和转移能力，具有鼻咽癌肿瘤干细胞潜能。关键词：干细胞；肿瘤干细胞；鼻咽癌；肿瘤干细胞标记物；CD34主题词：鼻咽肿瘤；肿瘤干细胞；抗原,CD34；组织工程基金资助：邢台市科技支撑计划(2013ZC062)肿瘤干细胞标志物CD34在鼻咽癌细胞增殖和转移中的作用鼻咽癌细胞系FACS分离CD34+和CD34-细胞FACS分析CD34在4种鼻咽癌细胞系中的表达克隆形成能力分析CD34+和CD34-细胞增殖能力划痕实验分析CD34+和CD34-细胞迁移能力MTT分析CD34+和CD34-细胞增殖能力张军红，等.恶性肿瘤干细胞标记物CD34在鼻咽癌细胞系的表达ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH3375(1DepartmentofPathology,3DepartmentofOtolaryngology,4KeyLaboratoryofOphthalmologyofHebei,5Laboratory,OphthalmicHospitalofHebei,OphthalmicInstituteofHebeiProvince,Xingtai054000,HebeiProvince,China;2DepartmentofOrthopedics,AffiliatedHospitalofGuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,GuizhouProvince,China)AbstractBACKGROUND:PreviousresearchhaveconfirmedthatCD34iscloselyrelatedtooncogenesis,progress,recurrence,metastasisanddrug-resistanceofvariouscancers,butitsroleinnasopharyngealcarcinomaremainsunclear.OBJECTIVE:TosortcellspositiveandnegativeforCD34innasopharyngealcarcinomacelllinesandtodetectcellproliferationandmigration.METHODS:ExpressionsofCD34innasopharyngealcarcinomacelllines5-8F,6-10B,CNE1andCNE2weredetectedbyflowcytometry.AndCD34+andCD34-cellsweresortedbasedoncellsurfacemarkersforpurityidentification.Afterwards,proliferationandmigrationofCD34+andCD34-cellsweredetectedbyMTTassay,colony-formationassayandscratchassay.RESULTSANDCONCLUSION:AllfournasopharyngealcarcinomacelllinesexpressedCD34in0.1%-0.2%,andthelevelofCD34wascloselyrelatedtothecellgrowthdensity.ThepurityofCD34+cellwasmorethan98%inthesortedCD34+cellpopulations,butnoCD34+cellswerefoundinthesortedCD34-cellpopulations.At1,3,5and7daystheproliferationrateofCD34+cell,populationswassignificantlyhigherthanthatofCD34-cells(P0.05).Consistently,thecolony-formationefficiencyofCD34+cellwassignificantlyhigherthanthatofCD34-cells(P0.05).Moreover,CD34+cellsmigratedsignificantlyfasterthanCD34-cellsbyscratchassay(P0.05).Inconclusion,CD34+cellsculturedinvitrodisplayhigherproliferationandmigrationcapacities,indicatingthatCD34+cellshavethepotentialofnasopharyngealcarcinomastemcells.Subjectheadings:NasopharyngealNeoplasms;NeoplasticStemCells;Antigens,CD34;TissueEngineeringFunding:theScienceandTechnologySupportProgramofXingtai,No.2013ZC062Citethisarticle:ZhangJH,LiQ,WangCH,WuXY,LuXG,WangLF,YangLL,WangQH.CD34,acancerstemcellmarker,innasopharyngealcarcinomacelllines.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(23):3374-3379.0引言Introduction鼻咽癌是中国南方地区发病率较高的恶性肿瘤，且机体发病早期未得到有效治疗，将会诱发其他疾病。另外，鼻咽部位淋巴组织相对丰富，发病早期即可以发生癌细胞的转移。鼻咽癌的常规方法主要以放疗为主，但是临床死亡率高[1]。数据显示，中国鼻咽癌患者5年生存率仅有50%，而转移及复发是其死亡率的主要原因[2-3]。从大的角度来说，肿瘤属于单克隆来源[4-5]，但是来源于同一克隆的肿瘤细胞之间也存在较大的差异，如表型、功能等，导致肿瘤细胞存在明显的异质性。肿瘤细胞群内存在较多具备干细胞特性的肿瘤细胞，它们在肿瘤的发生、发展以及治疗预后中发挥了重要的作用[6]。因此，分离、鉴定不同类型肿瘤干细胞，并了解其生物学特性，对鼻咽癌基因治疗具有重要的意义[7]。国外学者提出肿瘤的生长与肿瘤周围血管的生成存在紧密的联系，血管能够为肿瘤生长提供足够的养料[8-9]。CD34标记的不同肿瘤平均微血管密度存在明显的差异[10-11]。近年来，有学者从急性髓系白血病细胞系中分离出白血病干细胞[12-13]，免疫磁珠分选获得的CD34+CD38-细胞经克隆形成实验，证实了该群细胞具有白血病干细胞的特性，由此看出CD34+可能是肿瘤干细胞的表面标志物之一。但是，CD34在鼻咽癌中的表达以及自身的生物学特性尚缺乏报道[14]。为此，实验选取鼻咽癌细胞系作为研究对象，探讨恶性肿瘤干细胞标记物CD34在鼻咽癌细胞系中的表达，分析CD34在鼻咽癌发生、发展和转移中扮演的角色，能够为鼻咽癌靶向治疗提供新的靶标，对提高鼻咽癌患者的生存期具有重要意义[15]。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计组织基础分析。1.2时间及地点于2014年10月至2015年10月在河张军红，等.恶性肿瘤干细胞标记物CD34在鼻咽癌细胞系的表达P.O.Box10002,Shenyang110180北省眼科医院完成。1.3材料细胞株：人鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2购自中科院上海细胞库[16-17]。1.4实验方法1.4.1鼻咽癌细胞的培养分离4种鼻咽癌细胞株均采用含体积分数为10%新生牛血清的RPMI1640培养基，在37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养，细胞生长状态良好时用于实验[18]。1.4.2流式细胞仪直接免疫荧光法检测CD34的表达取贴壁生长、状态良好细胞制作单细胞悬液，计数1×106个细胞，PBS冲洗1次，用PB