293悬浮细胞SOP

北京辰欣汇智医药科技有限公司文件名称293悬浮细胞转染标准操作规程文件编号：SW-0022文件版本：01文件页码：1of2拟文部门生物部发放范围生物部执行日期：2014-02-01起草人审核人批准人293悬浮细胞转染标准操作规程1.0目的：规范293悬浮细胞转染相关操作，保证293悬浮细胞转染工作正常进行,确保获得高表达的293工程细胞。2.0适用范围：适用于生物部日常293悬浮细胞转染相关实验。3.0工作程序：3.1细胞复苏：操作者按照《哺乳动物细胞复苏标准操作规程》要求，复苏293悬浮细胞于25CM2培养瓶中，培养体积为5-7ml，放CO2培养箱，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%。3.2培养3-5天，细胞长满后，用移液管反复吹打细胞，使细胞重悬，将细胞悬液转至15ml离心管，1000rpm离心3min。3.3用无菌移液管轻轻将离心后的上清吸出，加入20ml新培养基，吹打、重悬细胞，将细胞悬液转入2个25CM2培养瓶，每个培养瓶10ml，放CO2培养箱，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%。3.4当细胞密度长到2×106cells/ml左右时，用无菌移液管吹打培养瓶内的细胞，是细胞重新悬浮成单个细胞，将细胞转至125ml细胞摇瓶中，补充新鲜培养基至30ml，放CO2摇床，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%。3.5培养3-4天，细胞密度达到1×106cells/ml左右时，收集细胞悬液，1000rpm离心3min。3.6弃上清，用60ml新鲜培养基重悬细胞，将细胞转至250ml细胞摇瓶中，放CO2摇床，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%，摇床转速为125rpm。北京辰欣汇智医药科技有限公司文件名称293悬浮细胞转染标准操作规程文件编号：SW-0022文件版本：01文件页码：2of2拟文部门生物部发放范围生物部执行日期：2014-02-01起草人审核人批准人3.7培养2-3天，细胞密度达到2×106cells/ml左右时，1:3传代至新摇瓶，传代后细胞密度为5-6×105cells/ml，摇瓶放CO2摇床，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%，摇床转速为125rpm。3.8培养1-2天，细胞密度达到1-1.2×106cells/ml左右时，进行转染。3.9质粒DNA中加入0.5-3ml不等的70%乙醇，10000rpm离心5min，吸去上清，将离心管倒置于吸水纸上，室温晾干。3.10使用20-100ul不等的TE或蒸馏水溶解质粒DNA，-40℃保存。3.11-40℃和室温条件下，反复冻融质粒DNA两次。3.12将质粒DNA浓度调整为1mg/ml，吸取50ul质粒DNA溶液加入到1.45ml转染用培养基中，轻轻混匀。3.13吸取50ul脂质体溶液加入到1.45ml转染用培养基中，轻轻混匀。3.14用无菌枪头吸取含脂质体培养基，枪头深入到含质粒DNA培养基中，边轻轻晃动含质粒DNA培养基，边缓慢加入含脂质体培养基，注意不要出现沉淀。3.15室温静置10min（不要超过20min），轻轻加入到27ml，细胞密度在1-1.2×106cells/ml，状态良好地细胞悬液中，摇瓶放CO2摇床，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%，摇床转速为130rpm。3.16转染2-10天（建议4天左右），收获细胞培养上清。4.0相关/支持性文件：无。