开发安全的人类多能干细胞治疗策略

1开发安全的人类多能干细胞治疗策略翻译：何君贤原文作者：MelissaKCarpenter,JoyceFrey-VasconcellandMahendraSRao原文检索：Carpenter,M.K.,J.Frey-Vasconcells,andM.S.Rao,Developingsafetherapiesfromhumanpluripotentstemcells.NatBiotech,2009.27(7):p.606-613摘要：将人类的多能干细胞(pluripotentstemcellsPSC)推进到细胞治疗层面需要开发出检测产品均一性、稳定性、致瘤性、毒性和免疫原性的标准化检测方法。前言：细胞治疗是现代医学领域最有前景的几种治疗方法之一，若干治疗方案正在产业界和科研小组中酝酿。自1968年第一例骨髓移植错误!未找到引用源。成功以来，基于成人干细胞的治疗方案已经在临床上应用了数十年。在这几十年的发展中，细胞治疗技术取得了巨大的发展。与此相应，监管机制也发生了巨大变化。(在美国)，细胞治疗受美国食品药品监督管理局的“良好组织操作规程”(GoodTissuePracticesFinalRule)监管。该操作规程对与细胞治疗有关的风险进行分类监管(表1)。一批细胞产品，比如软骨细胞和人造皮肤已经获得了FDA的批准(表2)。尽管与干细胞相关的产品目前还没有获得批准，但是该类产品中已经有几种处于晚期临床试验阶段了(表2)。表1.监督管理机制类别监管机制适用范围举例一类不受FDA21CFR1271法案监管基于细胞的制品，不涉及人类细胞/组织的细胞产品；没有或很小的处理；同源使用；不与药物或者设备搭配使用器官移植、全血来源的产品、高剂量化疗或全身放疗后的骨髓移植二类“361”受公共健康安全法案第361部位监管经过较小处理的基于人类细胞/组织的产品；同源使用；不与药物或设备混合使用；自体使用或者具有一级或二级血缘关系的亲属间使用比如将右膝软骨和左膝软骨进行外科移植；用于治疗恶性血液疾病，从外周血分离纯化的CD34+簇造血细胞三类“351”受公共健康安全法案第351部分监管经过培养或者处理的人类细胞/组织产品；不是以同源治疗为目的；结合药物或仪器使用；异体使用利用扩大的人类神经干细胞以传输溶酶体酶类；在心肌梗死治疗中使用的人类胚胎干细胞来源的心肌细胞对于成人干细胞治疗或者多能干细胞治疗来说，其一般操作流程是首先将未分化干细胞(undifferentiatedstemcell)扩大培养，然后体外诱导其分化成某种特殊类型的细胞，将这些诱导生成的细胞通过一定的方法输送到病人体内，最后使这些细胞长期定居在病人体内发挥作用。围绕这一干细胞治疗流程所设立的一些监督管理办法主要是基于活细胞的一些特征而设立的。活细胞在体内或者体外都会随着时间的变化而发生改变，这些细胞所生存的环境总体上是复杂多样的。活细胞被移植到体内后会发生整合和迁移，与宿主系统，比如局部环境和免疫系统，发生相互作用。但是，干细胞来源的细胞产品除了具有上述特征外还具有以下两个额外特征使得它们与众不同：超强的自我复制能力和多能性。细胞的高度自我复制能力保证了能够进行大规模的商业化生产，但是同时也提出了新的要求，即有必要对在体外经过2一定时间培养后的细胞的稳定性进行评估。细胞的多能性是诱导生成特殊的细胞类型的前提，但同时这一特性也有可能导致肿瘤的产生和生成不需要的细胞。本文将重点讨论干细胞治疗所涉及监管控制等议题错误!未找到引用源。。由于第一个被授权的干细胞临床试验是人类胚胎干细胞(humanembryonicstemcellshESCs),本文将围绕人类胚胎干细胞展开讨论。同时，我们也留出一点空间来讨论与诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcellsiPSCs)相关的一些特殊议题。表2.市场上目前正在使用的或者处于晚期临床试验阶段的细胞治疗产品产品描述用途目前状态软骨Carticel自体软管细胞软骨替代已获批上皮Epicel自体成纤维细胞皮肤替代已获批人造皮肤Dermagraft异种成纤维细胞皮肤替代已获批人造细胞Transcyte异种成纤维细胞皮肤替代已获批人造皮肤Apligraf异种成纤维细胞皮肤替代已获批间充质细胞Prochymal人类成熟间充质干细胞移植物抗宿主疾病3期临床肌细胞MyoCell自体来源的骨骼肌细胞扩大培养物充血性心力衰竭3期临床ALD-101细胞脐带血细胞亚群遗传性代谢疾病；溶酶体缺乏症；过氧化物蓄积疾病；造血干细胞移植3期临床为了证明hESC来源的治疗手段的安全性需要对原始材料进行检测、评估；证明细胞再生和细胞处理方案的可重复性；对最终产品的均一性进行分析；对细胞的体内特征如体内的分布、致瘤性、毒性和免疫原性进行分析。上述某些议题已经在讨论细胞治疗的文章中进行了阐述错误!未找到引用源。。本文将着重对具有特殊挑战性的议题包括hESCs的分离、产品的均一性、细胞的稳定性、致瘤性、毒性以及免疫原性进行讨论。1.hESCs的分离目前所使用的大部分hESCs都是以研究为目的，用小鼠饲养层为辅助材料分离获得的。目前FDA还没有专门针对为临床应用而进行hESCs分离的指导方案。所以，目前研究者只能参照在体细胞治疗方面的指导方案来进行hESCs的分离操作。在这样的指导方案下，用于临床的hESCs的分离需要遵循“良好的组织操作”(GoodTissuePracticeGTP)和“良好的生产操作”(GoodManufacturingPracticeGMP)方面的要求。这些要求包括供体的合格性，在hESCs的采集、筛选、测试、处理、储存、标记、包装和分发过程中都遵循GMP规程。详细的规程在21CFR210&211中有描述(见表3中有关FDA指导方案的链接和参考材料)。但是，目前遵循GTP/GMP规程进行hESCs的分离已不现实。比如用于人工生殖的体外生产的的胚胎虽然可以成功受孕，但是却不符合GTP/GMP操作规程。GTP规程下的“供体合格性”要求对供体进行一系列的筛查，包括对每个供体家族史和血液样本的筛查。在临床体外受精操作中一般没有做这些筛查，所以当这些体外受精所剩下的胚胎被捐献出来用于分离hESCs时也就很难实施规程中所要求的筛查了。考虑到严格遵照GTP/CMP进行hESCs分离的现实困难，我们的焦点将集中到这些规范的要旨，即确保细胞产品不会被一些偶然的成分所污染。所以，只需要按照FDA的“细胞系特征鉴定注意事项指导方针”(PointstoConsiderintheCharacterizationofCellLinesguideline见表3)对起始材料和最终的细胞产品进行检验就足够了。针对hESCs进行检验可3以缓解缺少供体信息的困难。考虑到hESCs的高度自我复制的特性，即使GTP原则下的指导方针还没有完善起来，建立大的主细胞库和工作细胞库(masterandworkingcellbanks)也是有可能的。这些细胞库包括足够多的细胞用于对污染物进行检测。确实，将来按照GTP原则所生产的细胞系也不是必须进行临床注册。今年(2009年)一月，FDA就批准了Geron公司(美国，加利福尼亚，Menlo公园)的用少突胶质细胞前体细胞进行新药研究的申请，这种前体细胞所来源的hESCs系是科研实验室以小鼠饲养层为辅助材料所分离的第一个hESCs系所错误!未找到引用源。。然而，随着该领域的不断进步，将来会生产更加符合GTP/GMP规范的细胞系用于临床实践和产品开发。有几个研究小组正在针对规范中的要求开发“临床级”(clinical-grade)hESCs(即这些细胞系是在接受了GMP原则下的充分测试而产生的)，其中一个小组报道已经开发出了6个这样的细胞系错误!未找到引用源。.表3.开发干细胞治疗的参考材料参考资料链接评审人员指南人类体细胞治疗研究新药申请化学、生产、控制评审人员指导说明和模板评审员和资助者指南化学、制造和控制内容和回顾人类体细胞治疗研究新药申请信息产业指南：关于异种移植产品在人上使用的动物、产品、临床前和临床期的问题产业指南：针对开发人类细胞、组织和基于人类细胞、组织的产品现行的良好组织操作规范(CGTP)对用于生产生物制品的细胞系进行特征鉴定时需要考虑的问题(1993)产业指南：人类体细胞治疗和基因治疗指南产业指南：人类细胞、组织或者基于人类细胞、组织的产品的捐献者合格性确定产品的均一性(Productconsistency)生产基于hESCs的产品的目的就是能够在一种具有充分的安全防范措施、无菌、可追溯的洁净环境下生产出数量充足的、均一的细胞。为了实现这种目标，就需要开发一种可以获得充足细胞数量的扩增方法，一种精确的诱导分化方法和经过验证的分析方法，以此来保证所生产的产品批与批之间具有很好的均一性。只要在符合GMP规范的环境条件下使用标准操作方案和开发有效的监测整个生产环节均一性的检测方法就可以大体上达到这种均一性要求。但是，对“均一性”的明确却具有很大的困难，因为与小分子不同的是，细胞是一种有生命的有机体，并会随着时间的变化而发生改变。为了保证均一性，需要特别注意减少4起始材料的差异、分化调控方法以及生产流程，并且要对终产品进行严格的功能和成分检查。图1显示的是生产制造干细胞产品所涉及到的若干步骤。图1.显示干细胞产品开发的生产工艺流程。cGMP:现行良好生产操作规范(currentGoodManufacturingPractice)。2.1在差异性起始材料前提下保障产品均一性的措施目前基于hESCs进行治疗策略开发的一般模式中一般是希望根据单个细胞培养建立一个群体，然后在体外进行适当扩增，以此为基础建立一种经过验证的hESCs主细胞库。如果一种细胞产品来源于单一的一个细胞系―这种现象在培养的早期可以发生－差异性就有可能存在于主细胞库中的各个细胞瓶之间。在细胞库中对细胞的构成成分进行彻底的检测可以解决差异性的问题。但是，对均一性的担忧会随着为人类白细胞配型而建立起来的，供体多样的细胞库的增加而增加。数百