开放性实验论文

小鼠海马神经元放电特性研究学院：物理电子工程学院专业：电子信息科学与技术年级：2014级指导老师：杨丽作者：王洲洋，韩佩，郭豪杰Ⅰ摘要本实验采用7-8天小乳鼠进行实验，断头取脑后用急性分离的方法得到小鼠海马神经元细胞，再用膜片钳技术测定神经元细胞的放电特性，在数据采集与处理阶段主要使用Pclamp10.5，用Clampex软件采集电信号，用Clampfit软件对所采集数据进行分析，得到小鼠海马神经元的放电特性。实验对小鼠海马神经元细胞放电特性的研究对人体细胞放电特性的认识有重要的指导意义。本文主要分三部分介绍实验过程，在第一部分中将主要叙述小鼠海马神经元细胞的急性分离原理及方法；在第二部分将对膜片钳技术进行详细叙述；第三部分将介绍Clampfit软件的使用方法。在第四部分中我们通过分析以往同类型实验的实验数据，总结得到不同电磁场对小鼠海马神经元细胞离子通道的影响。关键词：海马神经元急性分离膜片钳技术细胞膜离子通道ClampexⅡ目录一、大鼠海马神经元急性分离...............................11、引言........................................................12、材料与方法..................................................12.1材料及仪器.............................................12.2制备方法...............................................3二、细胞膜离子通道膜片钳研究方法.........................41、膜片钳技术..................................................42、膜片钳基本原理..............................................53、膜片钳技术记录模式..........................................64、膜片钳技术测量方法..........................................8三、Clampfit软件的使用方法.............................111、基本操作....................................................112、标准I-V图的制作............................................133、曲线拟合方法................................................15四、对以往实验的总结与分析..............................181、不同强度工频磁场照射对神经细胞离子通道的影响................182、不同强度恒定磁场对神经元细胞离子通道的影响..................183、射频磁场对神经元细胞离子通道的影响..........................204、结论........................................................20参考文献...............................................211一、大鼠海马神经元急性分离1、引言海马结构位于侧脑室下角底内，是种系发生上比较古老而简单的皮质部分，具有一致的组织结构，细胞分层排列，是研究中枢神经系统解剖和生理的可塑性模型。随着种系进化，其相对体积减少，绝对体积增加，在人类达到了高水平。根据Isaacson(1974年)的分层法，可将海马的细胞结构分成七层，即分子层、隐窝层、辐射层、锥体细胞层、多形细胞层、海马槽和上皮细胞层[1]。其中，位于辐射层下面的锥体细胞层是海马的锥体细胞聚集区，分离的该区锥体细胞具有典型的中枢神经元代表性。作为边缘系统的一个重要部分，海马与许多高级神经活动、行为反应以及植物性神经功能有重要关系，一直被视为神经科学研究的模型[2]。由于海马与学习、记忆关系密切，且对缺血和缺氧、癫痫、衰老、化学损害剂和有害物理辐射等许多致病因素较为敏感，近年来越来越引起研究者的广泛兴趣。2、材料与方法2.1材料及仪器动物：小乳鼠，鼠龄7~8天，雌雄不限。山西医科大学实验动物中心提供。试剂：PronaseE，河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)、氯化镉(CdCl2)、4-氨基吡啶(4-AP)、氯化四乙铵(TEA-Cl)、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、己二醇-双（2-氨基乙基）四乙酸（EGTA）、氯化铯（CsCl）、2氟化铯（CsF）、Na2ATP。（1）孵育液（ACSF）（mmol/L）：NaCl128，KCl5，NaH2PO41.5，MgSO42，CaCl22，NaHCO325，Glucose10，HEPES10，KOH调节pH7.4。（2）全细胞电流记录液细胞外液(mmol/L）：NaCl130，KCl5.4，CaCl22，MgCl21，Glucose10，HEPES10，NaOH调节pH7.4。电极内液（mmol/L）：KCl120，MgCl21，CaCl21，HEPES10，EGTA10，KOH调节pH7.3。（3）钠电流记录液标准细胞外液（mmol/L）：NaCl50，KCl5.4，CaCl22，MgCl21，Glucose10，HEPES10，AchCl90，NaOH调至pH7.3。电极内液（mmol/L）：CsCl70，CsF70，HEPES10，EGTA10，Na2ATP3，MgCl22，CsOH调至pH7.2。（4）钾电流记录液标准细胞外液（mmol/L）：NaCl130，KCl5.4，CaCl22，MgCl21，Glucose10，HEPES10，NaOH调节pH7.3。电极内液（mmol/L）：KCl130，MgCl22，CaCl21，HEPES10，EGTA10，Na2ATP2，KOH调节pH7.2。（5）钙电流记录液标准细胞外液（mmol/L）：NaCl130，KCl5.4，CaCl22，MgCl22，Glucose10，HEPES10，NaOH调节pH7.3。3电极内液（mmol/L）：CsCl140，HEPES10，EGTA10，Na2ATP3，Tris调节pH7.2。仪器设备：膜片钳放大器、微电极拉制仪、微电极抛光仪、微电极操纵器、倒置相差显微镜、电子天平、渗透压仪、酸度计、恒温水浴箱、磁力搅拌器、超净工作台、防震台、磁场发生装置。解剖器械、烧杯、容量瓶、刻度滴管、移液器、培养皿、Pasteur吸管、离心管等。2.2制备方法2.2.1大鼠海马神经元急性分离[3](1)取材和切片：大鼠断头取脑，取出整个脑组织并快速移入冰冷(0~4ºC)的孵育液中约1min，冷却后放在冰盘上沿矢状缝纵向切开左右侧大脑半球，快速剥离出双侧海马，沿海马长轴手工切成400~500μm厚的脑片，置于孵育液中，整个过程不超过5分钟。(2)孵育：将脑片室温下平衡孵育50min，孵育过程中连续通入95%O2+5%CO2的混合气，注意气泡大小，避免脑片翻滚，以防止神经元损伤。(3)酶解：将孵育后的脑片移入含有Pronase酶的消化液中，浓度为0.5mg/ml，32ºC恒温水浴中消化20min。其间通入95%O2+5%CO2的混合气，同样要防止气泡吹到脑片。(4)洗酶：消化完毕后用孵育液冲洗脑片3~4次，洗净脑片表面的酶液。4(5)吹打和贴壁：在盛有孵育液的离心管内，依次用经热抛光的口径递减的数个Pasture吸管轻轻吹打脑片，直至组织块分散，制成单细胞悬液。竖直静置约5min，吸取上清液，加入放有盖玻片的培养皿内，约20min后细胞贴壁。(6)脑片保存：暂时不用的脑片置于孵育液中，并持续通95%O2+5%CO2的混合气，脑片可存活4~6h。二、细胞膜离子通道膜片钳研究方法1、膜片钳技术膜片钳技术与电流钳，电压钳技术在命名上并不完全一致，后两者是电学概念的角度命名的，“膜片钳”主要是从机械物理学角度命名的。膜片钳技术钳制的是“膜片”，是采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其他细胞分离，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来、此外，膜片钳技术之所以能够记录到非常微弱的单通道离子电流，除了因为电极与细胞膜之间形成的紧密接触外，还得益于特殊设计的低噪声膜片钳放大器、采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可以记录单通道电流，从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术，它可记录到流经单通道的电流。后来，随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，出现了全细胞记录模式等其他模式，而且也不仅仅采用电压钳技术，还常采用电流钳技术。它是一种过微电极与细胞之间形成紧密接触的方法，采用电压钳5或电流钳技术对生物膜上离子通道的电活动（尤其是可对单通道电流）进行记录的微电机技术。广义上讲，虽然膜片钳技术的主要研究对象是细胞膜上的各种通道，但几乎任何跨越细胞的离子流动都可用膜片钳技术记录到并加以研究，这些电流还包括门电流，一些泵电流，交换体电流以及电容电流等等。2、膜片钳基本原理膜片钳技术是用微玻璃电极（膜片电极）接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，使与电极尖端开口处相接的细胞小区域（膜片）与周围在电学上绝缘，然后在微电极另一端开口处施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在这一小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间，会形成紧密的封接，其电阻可达数个或数十个千兆欧，这实际上把吸附在微电极尖端开口处的那一片膜同其余部分的膜在电学上完全隔离出来，由微电极记录到的电流变化只同该膜片中通道分子的功能状态有关。如果在这一小片膜中只包含了一个或少数几个通道蛋白分子，那么通过微电极测量出的电流，就是某种带电离子经由开放的单一通道蛋白质分子进行跨膜移动的结果，实现了对膜片上离子通道的离子电流（pA级）进行监测记录的方法[4]。图2-1给出了膜片钳技术的原理图，其中𝑅𝑠是与膜片阻抗相串联的局部阻抗（或称输入阻抗），Rseal是封接阻抗。𝑅𝑠通常为1到5MΩ，如果Rseal高达1GΩ以上时,𝐼𝑃𝐼⁄=𝑅𝑠𝑒𝑎𝑙(𝑅𝑠+𝑅𝑠𝑒𝑎𝑙)⁄−1，此𝐼𝑃可作为在I−V转换器内的高阻抗负反馈电阻(𝑅𝑓)的电压降而被检测出。实际上这时场效应管运算放大器6(𝐴1)的输出中包括着命令电压成分，这部分将在通过第二级场效应管运算放大器时减掉。图2-1膜片钳测量原理图3、膜片钳技术记录模式根据细胞膜片与电极之间的相对位置关系，膜片钳记录有以下几种方式，即细胞贴附模式、膜内面向外模式、膜外面向外模式、全细胞模式和穿孔膜片模式等[5]。当电极与细胞膜接触后，给以轻微的负压开始进行封接，封接电阻大于1GΩ时即形成细胞贴附模式记录；若此时轻拉电极，使电极局部膜片与细胞体分离而不破坏GΩ封接，便可形成膜内面向外模式记录；若在细胞贴附式的基础上给以短暂脉冲负压或电刺激打破电极内细胞膜，便形成全细胞模式；若由全细胞模式再轻拉，可形成膜外面向外模式；若在形成细胞贴附模式后不是将膜吸破而是将电极内液加入打孔剂，便可形成穿孔膜片钳模式。根据不同的实验目的和要求，来选择不同的记录方式，图2-2为膜片钳技术记录模式示意图。7图2-2膜片钳记录模式示意图全细胞膜片钳技术可分为电流固定模式和电压固定模式，前者是在固定电流的条件下检测与其相应的膜电位。例如将电流固定在零时，可检测细胞的自然应答（静息膜电位、自发性膜电位振动或自发性动作电位等）。后者是在电位固定的基础上检测钳制电压时的膜电流。图2-3为全细胞记录模式的示意图和等效电路图。RS、RCell、RSeal分别为串联电