引物延伸分析(primerextensionanalysis)

引物延伸分析（primerextensionanalysis）主要用于mRNA5′端作图。poly（A）+RNA首先与过量5′端标记的且与靶RNA互补的单链寡核苷酸引物杂交，然后用反转录酶延伸这个引物。产生的cDNA与RNA模板互补且长度与引物5′端和RNA5′端之间的距离相等。该法在mRNA5′端作图方面具有下述优势：一旦引物被子起始合成，延伸反应大多会进行到RNA模板的5′最末端，产物大小可精确测定。此外，产物长度不会受靶基因内含子分布与大小的影响。几乎所有的引物延伸实验多采用长20~30bp合成寡核苷酸引物。当用于和靶序列杂交的寡核苷酸引物位于距mRNA5′端150bp以内时，可获得最佳结果。在更远距离处杂交的引物能增加异源延伸产物，因为反转录酶会在模板RNA的二级结构复杂区终止。因此，在设计引物时，除实际的序列之外还应考虑到杂交的位置。应尽可能使寡核苷酸的GC含量在50%左右且在3′端为G或C。用两个引物在mRNA相距一段已知距离（20~50bp）的区域上分别杂交则更为理想。大小差别等于两个引物间距的延伸产物，可对结果进行验证。为了找到一对能产生明确延伸产物的引物，合成多个引物也许是必须的。在很多情况下，引物延伸反应会产生两个产物：全长cDNA分子和短2~2bp的反转录产物。这可能代表着多个转录起始位点导致的mRNA5′端不均一性。有时，在临近靶mRNA加帽位点的甲基化残基处的提前终止将产生更短的产物。与帽子结构相关的条带在不同mRNA样品中的化学定量是不同的，对于一份给定样品总是一个定值。为了区分反转录假象和真正的mRNA5′端不均一性，用5′端标记的探针进行S1核酸酶分析是一个很好的方法。与未进一步分离的哺乳动物RNA相比，poly（A）+RNA样品可得到干净得多的结果，因为前者分产生多到不可接受的提前终止产物。通过在更高浓度（5mmol/l）dNTP下进行延伸反应，并在用互补区位于mRNA5′端50~100bp以内的引物可将假象降至最低。用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸引物一度是必须的。这些年来，除非总是产生延伸产物的梯状条带，许多研究者已不再费心纯化了。在杂交反应中，核苷酸引物分子的量应大约10倍于靶mRNA。更多量的引物可能会导致非特异延伸和人为条带的出现。所以，且一定量RNA与不同量的引物（通常为20~40fmol，104~105cpm）进行一系列预实验是可取的。复性温度极大地影响引物延伸实验的质量，值得在预实验中调查以确定最佳复性温度。多数情况下，对于GC含量为50%，20~30bp的引物，其最佳复性温度在40~60℃之间。可以设置一系列以5℃为间隔的引物延伸反应来确定最佳复性温度。当用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析延伸产物时，大小已知、末端标记的DNA片段可用作相对分子质量标记参照物。但最好是采用与延伸反应相同引物的基于DNA模板的测序图，通过对照测序图读出引物延伸反应产物的大小，靶RNA的5′端可定位于一个特定的碱基。在研究启动子区时往往采用引物延伸分析（primerextensionanalysis，看了些相关资料，感觉收获不小，和大家分享一下。1、引物延伸分析（primerextensionanalysis）引物延伸分析用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端，确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA,长度为20-40个核苷酸，与要分析的转录产物的5`末端区域互补。延伸产物小于150个核苷酸，可得到最佳分离效果。引物延伸实验非常灵敏，可检测2pg的转录产物，这相当于1个细胞中的1个RNA。引物延伸实验非常适合于对单个基因作定量和定性分析。（1）引物延伸分析所用试剂：引物延伸实验需要模板RNA，可用总RNA或poly(A)+RNA。一个特异的末端标记的核苷酸或DNA片段作为引物，用反转录酶合成cDNA。除RNA模板和标记的引物，还需要反转录酶，AMV或MMLV反转录酶、反应溶液、脱氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝胶试剂，和电泳装置。所得结果用放射自显影和磷成像仪分析。（2）引物延伸系统的组分：引物延伸系统中AMV反转录酶和反应溶液、焦磷酸钠、正对照RNA模版和对照引物、去磷酸的PhiX174HinfIDNA标准分子参照物、T4多核苷酸激酶和溶液、样品溶液、AMV反转录酶2X溶液100mMTris-HCl（pH8.3,42℃）、100mMKCl、20mMMgCl2、20mMDTT、2mM每一种dNTP、1mM精胺。PhiX174标准分子参照物和T4多核苷酸激酶用作引物标记，和确定延伸产物长度的标准。对照RNA可得到87个碱基的延伸产物作为正对照。引物延伸反应中用焦磷酸钠和精胺可增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。虽然其作用方式未确定，但结果是增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。MMLV被焦磷酸钠和精胺抑制，如使用MMLV，放线菌素D可用于增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。焦磷酸钠和放线菌素D抑制cDNA第二条链的合成。（3）引物延伸实验的优化：①杂交温度。引物延伸实验中所用的杂交温度是最关键的需优化的因素。一般而言，最高紧密度，或引物和互补序列完全杂交所需的最适条件是，低于引物溶解温度的5oC。低于最高紧密度的温度可极大地增加杂交速度。应在不同的紧密度的杂交温度下作杂交，以控制引物和特异RNA的杂交。增加杂交紧密度时，带来的延伸产物的丢失表明，引物和相关的却不是等同的转录产物杂交。在碱和双价阴离子的存在下，RNA在较高温度会降解，应用甲酰胺杂交操作方案，这可有效降低溶解温度，因此可使杂交在较低的温度进行。可在杂交步骤中用以下的溶液：40mMPIPES、1mMEDTA、0.4mMNaCl、80%的甲酰胺。如用这个杂交溶液，延伸步骤前甲酰胺和盐需用乙醇沉淀后除去。②模板RNA和引物的量。以下讨论了所用RNA模板和引物的起始量。反转录酶对不同模板使用的效率不同。这部分是由于RNA中存在的次级结构干扰反转录酶的聚合酶活力。如产生短的产物，这通常不是一个问题。如用AMV反转录酶，延伸温度可达55℃。③每次反应所用RNA的量。每次反应所用RNA和引物的量取决于分析的RNA的种类（总RNA或poly(A)+RNA），目的RNA的相对丰度。如用总RNA，起始量为10ug，但分析稀有信号，每次反应用100ugRNA。poly(A)+RNA每次反应用0.1-1.0ug，具体决定于总RNA中poly(A)+RNA的富含量，需分析的特异RNA的浓度。在引物延伸分析前需检查目的RNA的完整。通过凝胶分析总RNA，应有完整的18S和28S核糖体RNA带。在引物延伸反应中用Northern印迹和RT-PCR分析来确定特定RNA的存在。④每次反应所用引物的量。用引物延伸实验定量RNA，标记的引物必须多于目的RNA。引物应是互补RNA的5-10倍。但一般，总RNA或poly(A)+RNA中，特定目的RNA量未知。对未分析的转录物，初次分析用50ug总RNA和100fmol引物。如所有RNA中与引物互补的位点饱和，测试信号和投入的RNA的量成正比，而不依赖于引物的浓度。引物应至少为20个核苷酸，杂交位点应位于转录产物5`-末端下游的100个碱基处，而不会自互补。也可用从限制性酶切片段所得的ssDNA作为探针，长度应不长于50-100个核苷酸，以获得最佳分辨率。⑤AMV和MMLV的选择。引物延伸反应通常用AMV，AMV性能更好，对次级结构耐受。用AMV的延伸温度可达55℃,以消除次级结构，但在这样温度下，引物延伸反应的得率通常降低。MMLV的最适温度为37℃，在更高温度下，MMLV不稳定，但MMLV可合成更长的产物，这一特点对引物延伸反应不适用，因引物延伸反应所得的产物一般较短，为100-500个核苷酸。⑥会导致非特异，短的和多个引物延伸产物的影响因子：所研究的转录的差异程度可导致产生不同长度的延伸产物，它们来源于选择式剪切和使用不同的转录起始位点。差异核RNA的存在也能导致产生多个延伸产物。引物和RNA中相关或无关序列的交叉杂交也会导致非特异延伸产物的产生。产物短于预测可能和RNA模板的降解有关，或者是转录产物中次级结构阻制了反转录酶的合成，产生断缺的cDNA。RNA样品中存在DNA污染同样可得延伸产物，加放线菌素D（75ug/ml）可抑制这类产物的产生。应作无RNA模板的负对照实验，以确定所用试剂中无RNA和DNA污染。同时还应用从不表达目的转录产物的细胞或组织中提取的RNA模板作负对照实验。（4）计算RNA转化为cDNA的量。RNA转化为cDNA的量可对引物延伸产物，和`无RNA`对照实验的cpm作测量得到。从凝胶中分别切割引物延伸产物和`无RNA`对照实验中产物，在闪烁液中测定凝胶块的读数，可有效平衡聚丙烯酰胺凝胶的湮灭和32P的衰退。以下的例子表明如何计算fmol的RNA转化为cDNA，在这个例子中，一半的引物延伸产物（20ul/40ul）加入凝胶中作分析。`无RNA`对照实验的引物浓度为100fmol，一半的反应液加入凝胶中作分析。切割的带的读数为：样品为3912cpm，引物为142359cpm，首先计算引物cpm/fmol：cpm/fmol=142359cpm/[100fmolX（20/40）]=2847cpm/fmol，接下来计算引物延伸产物的fmol，或cDNA：3912cpm/[2847fmolX（20/40）]=2.75fmolcDNA。所得值表明引物延伸中所得的cDNA的量。（5）确定引物延伸产物的精确长度的分子标准参照物。为确定引物延伸产物的精确长度，应同同位素标记的DNA分子标准参照物对照。DNA分子标准参照物末端作了标记，上变性凝胶前先作变性，引物延伸产物也作变性。长度在20-500核苷酸范围的分子标准参照物在确定引物延伸产物的长度方面很有用。去磷酸的PhiX174HinfIDNA标准分子参照物非常方便，已去磷酸，可作5`末端标记，分子标准参照物的长度为24-726核苷酸。用于引物延伸产物分离的聚丙烯凝胶的规格为16X18cm,含8%聚丙烯、7M尿素、1′TBE溶液。这种胶和测序胶很相似，故一般可用测序胶。应注意不使引物延伸产物和自由引物跑到胶外，特别是需对cDNA定量时。2、核酸酶S1作图（MappingRNAwithNucleaseS1）三种不同的核酸酶——S1核酸酶、RNA酶、外切核酸酶VII被用来进行RNA定量，确定内含子位置，及鉴定在的DNA模板上mRNA的5`-末端和3`-末端的位置。含有目的mRNA的RNA样品与互补的DNA或RNA探针在利于形成杂合体的条件下温育。在反应的末期，用核酸酶用来降解未杂合的单链RNA和DNA。余下的DNA-RNA或RNA-RNA杂合体用凝胶电泳分离，接着用自显影或Southern杂交来观察。当探针的摩尔数在杂交反应中过量时，信号强度与样品中目的mRNA的浓度成正比。用过量探针与一系列定量的靶序列杂交作出标准曲线，从而可准确估算样品的浓度。在真核系统中，S1核酸酶消化过的5`-末端通常代表转录起始点，而3`-末端代表聚腺苷酸化的位点。同样的策略可用来对拼接位点的5`-末端和3`-末端作图。