引物设计专题.

引物设计专题分子生物学实验基础之生物科学技术学院郭志富2011年11月8日PCR引物设计的目的：为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性。PCR引物设计的原则：①根据具体试验目的选取核酸序列特异区段设计－－７０％、８个以上连续碱基互补。②产物不能形成二级结构－－避开二级结构区。③引物长度一般在15~30碱基之间。④G+C含量在40%~60%之间－－Ｔm值相关。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5′端可以修饰－－引入酶切位点等。⑨引物3′端不可修饰－－延伸开始部位。⑩上下游引物间Tm值原则上不超过5度。常用软件：Primer5.0,Oligo,DNAman等简并引物设计：基于保守区设计，用于保守区片段（或中间片段）获得定量引物设计：用于半定量和实时荧光定量PCR标记引物设计：基于特异区设计，用于标记特异基因或特异物种材料。表达引物设计：用于原核体外表达、真核表达（转基因）SNP引物设计：用于单核苷酸突变鉴定RACE及染色体步移引物设计：基于已知序列，用于获取未知序列区段甲基化引物设计：用于检测基因甲基化情况。。。。。。引物设计分类ＰＲＩＭＥＲ５.０的常规应用结合ＤＮＡＭＡＮ激活软件？获取激活码“Ctrl+V”输入序列也可以把上下游引物分别设在序列的某一特定位置界定产物长度界定引物长度在55-65之间调整简并性引物的设计1.基于保守性的简并位置选择（3‘端尽量不设置简并）2.用Primer5.0检测大致的评分（主要看Tm值和发夹结构和引物二聚体情况）复制同源克隆---基于不同物种（范围较广）相应序列保守区的引物设计---通过已知序列信息钓取未知的同源基因“Ctrl+V”输入引物序列上游引物下游引物简并引物的确定（上游）5-CA(A/G)AAGAT(C/G/T)GA(G/A)AT(C/A)TT(C/T)AAATC-3如确定该位置为下游引物3-GT(T/C)TTCTA(G/C/A)CT(C/T)TA(G/T)AA(G/A)TTTAG-5表达引物的设计ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-------------------------------------------------------------------------------------GCAGTGCAGTCATGCAAAGCGTACGTACGTAGAAGTAGAATCC起始信号肽编码区N端编码区终止ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-------------------------------------------------------------------------------------GCAGTGCAGTCATGCAAAGCGTACGTACGTAGAAGTAGAATCCATGTCGGACGAAGCCGTACGTA上游引物的设计添加ATG起始密码子5-GCGAATTCATGTCGGACGAAGCCGTACGTA-3添加酶切位点1.编码区内不含该位点2.5’端添加保护碱基2-3个（网上有规律表）3.不能造成下游的移码去除信号肽编码区部分1.位置必须选择含终止密码子子位置或终止密码子之后不远的一部分序列，2.记得要是有义链的反向互补链，3.同样加酶切位点和保护碱基下游引物的设计定量引物的设计扩增长度：100-300bp范围即可以mRNA为模板进行设计尽量避免引物二聚体、发夹结构等的出现引物设计避免DNA污染可能带来的干扰，最好跨外显子接头区Tm值在58-62度内参引物设计：选取持家基因，如18SRNA、actin等长度与特异基因有所差异设计范围在编码区内界定产物长度在100-300bp应用Primer5.0软件常规应用功能即可标记引物的设计（特异性）选择非保守区段，特异性的位置设计在3‘末端；（SSR等特征序列的两侧）特异区段SNP引物的设计何谓SNP？SNP位点设置在3‘最后一个碱基倒数第三个碱基人为引入突变----保证引物特异性414-95%-99%与15一样3423-92%-99%3722-85%-96%435IRI-AY968588803IRI-AY96858934516-80%-98%可做34117-82%-93%35114-78%-99%同17相似34715-96%-99%ConsensusTGGATTGGCGAGCTTGATGGATTGGTGAGCTTGATGGATTGGTGAGCTTGATGGATTGGCGAGCTTGATGGATTGGTGAGCTTGATGGATTGGTGAGCTTGATGGATTGGTGAGCTTGATGGATTGGTGAGCTTGATGGATTGGCGAGCTTGAtTTTTTTTTTgGGGGGGGGGgGGGGGGGGGaAAAAAAAAAtTTTTTTTTTtTTTTTTTTTgGGGGGGGGGgGGGGGGGGGTTTTTTgGGGGGGGGGaAAAAAAAAAgGGGGGGGGGcCCCCCCCCCtTTTTTTTTTtTTTTTTTTTgGGGGGGGGGaAAAAAAAAA5-CTAGGTACTGGATTAGT-31014-95%-99%与15一样9423-92%-99%9722-85%-96%GATTGGTCGGCACCATCCCATCGTGGATTGGCGAGCTTGATCACCTTTGCTACTTGGATCTGTCGGATAATTCATTGGTTGGCGAGGTACCCAAGAGTTT......TCGGCACCATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGATCACCTTTGCTACTTGGATCTCTCGGATAATTCATTGGTTGGTGAGGTACCCGAGAGTTT...TGGTCGGCACCATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGAACACCTTCGTTACTTGGATCTCTCAGATAATTCATTAATTGGCGAGGTACCCAAAAGTTTATTGGGGTTTCCCGGGGGGCCCAAACCCCCCAAATTTCCCCCCCCCAAATTTCCCGGGTTTGGGGGGAAATTTTTTGGGGGGTTGGGAAAGGGCCCTTTTTTGGGAAATTCCCAAACCCCCCTTTTTTTTGGGCCTTTAAACCCTTTTTTGGGGGGAAATTTCCCTTTCCTTTCCCGGGAAATTTAAAAAATTTTTTCCCAAATTTTTTGGGGTTTTTTGGGGGGCCGGGAAAGGGGGGTTTAAACCCCCCCCCAAAAAGGAAAGGGTTTTTTTTT1984-95%-99%与15一样19123-92%-99%19422-85%-96%GATACGGCTCAAGGGTCTCGTCATCGTTGGT...CGTTCACTAGGTATGGTTTTTACGAACATGCCATTGTATGTGAAGCGTAATAGAAGAACACTCGACGATACAGCTCAAGGGGCTCGTCATAGCTGGT...CGTTCACTGGGTACGGCTTCTACTAATATGCCATTGTATGTCAAGAGCAACAGAAGAACACTCGATGATACGGTTCAAGGACATCACCATCGCTGGT...CGCTCACTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTATATGTGAAGAGTAACAGAAGAACACTCCAAGGGAAATTTAAACCCGGGGGCCTTTCCCAAAAAAGGGGGGGGCCCTTTCCCGGCCCCAAATTTCCGGGCCTTTGGGGGGTTTCCCGGGTTTTTCCCAAACCCTTTGGGGGGGGTTTAAATGGGGGGTTTTTTTTAAACCCTTAAAAAACCAAATTTGGGCCCCCCAAATTTTTTGGTTTAAATTTGGGTTTGGAAAAAAGGGCGGGTTAAAAAACCAAAGGGAAAAAAGGGAAAAAACCCAAACCCTTTCCCGGAAA2024-95%-99%与15一样19523-92%-99%19822-85%-96%G...AACG...AACC...AACCAAAAAACCCRACE及染色体步移引物设计：基于已知序列，用于获取未知序列区段RACE引物的设计如果基因是多拷贝或为多基因家族，须在所得不同片段特异区设计与接头引物Tm值相差不宜过大产生嵌套引物，位置合理甲基化引物的设计何谓甲基化？----亚硫酸氢盐----C变T准确寻找甲基化位点，至少一个，多多益善设计野生型对照CpG位置尽量靠3‘端一段基因组的序列是：5-GAGGGGCGGCCGCACCGGG-3甲基化引物：5-GAGGGGCGGTCGTATCGGG-3非甲基化引物：5-GAGGGGTGGTTGTATTGGG-3谢谢