形态观察方法

第三章细胞生物学研究方法进行初步观察形成可验证的假说设计对照试验收集资料解释结果作出合理结论查阅已有知识生物学研究模式生物第三章细胞生物学研究方法细胞形态结构的观察方法光学显微镜技术电子显微镜技术扫描遂道显微镜细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、光学显微镜技术lightmicroscopy普通复式光学显微镜技术荧光显微镜技术p53激光共焦扫描显微镜技术p53相差显微镜p51微分干涉显微镜p51录像增差显微镜技术倒置显微镜暗视野显微镜显微镜发展趋势重要的光学技术参数光镜样本制作采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。电子显微镜的基本知识主要电镜制样技术扫描电镜二、电子显微镜技术electronmicroscopy电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造1940年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜。直到1965年，才有英国剑桥科学仪器有限公司生产出实用性强的商品扫描电镜。由于扫描电镜具有显著的优点，广泛应用于生物学、医学、古生物学、地质学、化学、物理学、电子学以及勘察、冶金，机械与轻工业等领域，成为十分有用的研究工具。三、扫描遂道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）原理：量子力学中的隧道效应，原子间作用力、磁力、摩擦力等装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。特点：1、可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，分辨本领高（侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.001nm）2、可在真空、大气、液体等多种条件下进行非破坏性测量3、可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息4、可连续成像，进行动态观察用途：纳米生物学研究领域中的重要工具荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）原理与应用直接荧光标记技术间接免疫荧光标记技术在光镜水平用于观察能激发出荧光的结构。免疫荧光观察、疾病诊断、特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用激光共焦扫描显微镜技术（LaserConfocalMicroscopy）原理应用：用激光作光源，排除焦平面以外光的干扰，逐点、逐行、逐面快速扫描，增强图像反差。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，能扫描不同层次，形成立体图像。微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）计算机辅助的微分干涉显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动p51电子显微镜与光学显微镜的基本区别分辨本领光源透镜真空成像原理人眼0.2mm可见光光学显微镜200nm可见光(波长400～700nm)利用样本对光的吸收形成明暗反差和颜色变化100nm紫外光（波长约200nm）玻璃透镜不要求真空电子显微镜接近0.1nm电子束(波长0.01～0.9nm)电磁透镜1.33×10-3～1.33×10-5Pa利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差光镜与电镜的主要区别（1）光源不同光镜为可见光或紫外线；电镜为电子束（2）透镜不同光镜为玻璃；电镜为电磁透镜（3）真空（4）显示记录系统电镜与光镜光路图比较终像（眼或底片）目镜投影镜物镜样品聚光镜荧光屏成像中间像电子显微镜的基本构造主要电镜制样技术超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图负染色技术（Negativestaining）重金属盐对铺展在载网上样品染色，干燥后衬托出样品的精细结构金属投影冰冻蚀刻技术（Freezeetching）（技术示意图）冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。快速冷冻深度蚀刻技术（quickfreezedeepetching）电镜三维重构技术整装细胞电镜技术是观察细胞骨架的处理技术。扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）原理与应用：电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。特点：引起样品变形的表面张力问题---CO2临界点干燥法核酸大分子制样技术电镜显微放射自显影电镜整装细胞制片技术p63石蜡切片技术步骤：☆基本构造：光学放大系统、照明系统、机械和支架系统☆光学显微镜成像原理激发样本荧光保护眼睛特点：1、光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；2、有两个特殊的滤光片；照明方式常为落射式。①天然物质经紫外线照射后发荧光的物质，如叶绿素能发出血红色荧光。激光作扫描光源扫描焦平面上样品，得样品切面像载物台上微量步进马达使载物台上下移动,改变焦平面得不同层次的切面图像计算机图像三维重组获样品立体图像显微CT细胞内的各结构可因密度不同而产生相位差(即光程差)，不过人眼无法鉴别这种微小的变化。相差显微镜能够把透过标本的可见光的光程差或相位差，变成振幅差，提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。可用于观察活细胞。相差显微镜（phase-contrastmicroscope）1.环形光阑(annulardiaphragm)：位于光源与聚光器之间。2.相位板(annularphaseplate)：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ，将直射光与折射光分开。在构造上，特殊:1953年诺贝尔物理奖通过致密部分(如细胞核),速度慢通过疏松部位(如细胞质),速度快相位差(光程差)振幅差(明暗差)相差显微镜刀锋样品液态氟利昂液氮低温刀样品断裂示意图升华蚀刻碳铂用金属和碳喷镀，消化样品收集复型膜于载网上，置电镜下观察快速冷冻低温断裂蚀刻复型•20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。•分辨力为6～10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。扫描电镜工作原理：电子枪→电子束（φ20~30μm）→第一、二聚光镜→物镜（汇聚作用）→电子探针（φ几十埃）→在样品表面扫描，激发出多种电子信号（次级电子，电压信号）→检测器（捕获信号，经放大、转换）→电压信号→调制显象管亮度→显示图像→照相记录。•为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学。——是研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。DrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana植株小-15cm种子多-upto10,000seedsinaplant周期短-4weeksforacycle基因组小-5chromosomes140，000kb（基因组测序完成）紫外线为光源，照射被检物体发出荧光，在显微镜下观察形状及所在位置。首先汞灯发出紫外线，经第一次滤光片除去较长的波，使紫外线照到样品上。目镜下方滤光片除去紫外线，使可见光通过，以保护眼睛。•电子显微镜原理•以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50-120KV)的平方根成反比。•由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。•分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。•用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2µm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopicstructures）。1.普通光学显微镜玻璃透镜的工作原理原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。1数值孔径（镜口率）NA：指光镜的汇聚能力，N.A=n·sinα/2注：α--镜口角，n--介质折射率。空气--1、水--1·33、香柏油--1·515、溴萘--1·6镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线，与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度。α角小于180°，α/2小于90°，sinα/2最大值不超过1，因此N·A不会超过1。目前最好的显微镜α=140°一般的显微镜上标明10×/0.65、0.75、0.8等，就是指数值孔径，其大小代表了光镜汇聚光线的能力，α大，张角大，光通过的多、亮，透性好清晰物镜特性搜索物镜低倍镜高倍镜油镜放大倍数4×10×40-45×90-100×数值孔径值0.100.250.55-0.651.25-1.4焦距（f）40mm16mm4mm1.8-2.0mm工作距离17-20mm4-8mm0.5-0.7mm0.1mm450nm光源（蓝光）时的分辨率2.3m0.9m0.35m0.18m光学显微镜物镜的特性人眼的分辨能力在0.2mm左右，因此光学显微镜的最大有效放大倍数（使用油镜）是1,000×到1,400×。2分辨力/率（resdvingpower）：R，指25cm明视距离处，能分辨清楚尽可能靠近的两个质点的能力。辨认两点之间的距离越小，则分辨本领愈高。人裸眼的分辨力约为100μm，（实际上200μm才是理想的）。而显微镜分辨力则以下公式计算：R=0·61λ/N.Aλ-光源的波长可见光波长λ=0.45μm，α/2=70°，sinα/2=0.94空气折射率n=1，香柏油n=1.5空气R=0.61λ/N.A=0.61*0.45μm/（1*0.94）=0.3μm香柏油R=0.61*0.45μm/（1.5*0.94）=0.2μm光镜分辨率的最小数值为0.2μm。波长是定值（400nm~700nm），后者情况如何呢？如何提高显微镜的分辨率？R=0·61λ/N.A高的分辨力（R值小）----波长，镜口率。N·A也不能随意增大，一般在0·05~0·95，用香柏油（油镜）可达1·5，用溴萘可近1·6。这样，光镜的最大分辨力R=（0·61×550）/1·6=209（nm）（约为可见光最短波长的一半）。所以，R=0·2μm是光镜的极限，显微镜无论制作的如何精密，都无法突破这一极限。0.61λR＝n·sinθn:聚光镜和物镜之间介质的折射率.空气为1,油为1.5θ:标本对物镜镜口张角的半角.sinθ的最大值为1λ:照明光源的波长.白光为0.5μm3放大倍数/率（magnification）：M是最终成像的大小与原物体大小的比值（指长度）目镜放大倍数MF目=250mm（明视距离）/F目（目镜焦距）物镜放大倍数MF物=160mm(标准光学筒长)/F物(物镜焦距)总放大倍数MF总=标准光学筒长/F物×250/F目=物镜放大率×目镜放大率M是否越大越好？怎样提高M？最大放大倍数人眼的分辨率(～200m)光镜的分辨率(～0.2m)=～1000倍F目不能太短，因人眼瞳孔要与出射光孔重合，在10mm以上，放大率不高，约在（250/10）25，光学筒长（A）不能无限长，所以只有靠减小F物来提高总放大倍数。光镜有效放大倍数受到分辨力限制，只要将R=0.2μm，放大到人眼分辨力（0.2mm）大小，便能观察该物体。0.2mm×103/0.2μm=103（倍），超过此界限继续放大，人眼就看不清其细节，是模糊的空放大，无意义。一般光学显微镜的最大放大率只能是透镜的数值孔径的1000倍。透镜的数值孔径的范围是1.0～1.4，所以光学显微镜在用空气作介质时最大放大倍数为1000倍，用油镜则为1400倍。☆有效放大：上限：物镜镜口率×1000；下限：物镜镜口率×250