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土壤真菌多样性研究及真菌分类方法研究进展陈秋君201231142005经济管理学院12级20班摘要：简述了土壤真菌的多样性以及影响土壤真菌多样性的因子，介绍了土壤真菌分类方法近年来的研究进展。关键词：土壤真菌多样性影响因子研究方法0引言真菌是一类种类繁多、分布广泛的真核微生物.真菌多样性在维持生物圈生态平衡和为人类提供大量未开发的生物资源方面起到了重要作用.真菌构成了土壤的大部分微生物生物量,具有分解有机质,为植物提供养分的功能,是生态系统健康的指示物.在农业中,真菌既降低粮食产量,又为控制植物病虫害和其他真菌生物防治提供一条有效途径.对根际真菌结构和多样性的了解将有助于更好的了解真菌对病原菌的抑制功能.在林业中,丛枝真菌与植物相互共生作用,为植物提供养份,使植物能耐受干旱或贫养的条件,同时也提高了植物的多样性.在草地生态系统中,分解者生物量总体中78%~90%是真菌.20世纪60年代以来,微生物生态学研究发展较快,推动了土壤真菌学研究的发展,人们对探究土壤中真菌存在的形式、数量、活性以及它们在物质转化中的重要作用等方面充满兴趣。70年代以后人们更进一步认识到土壤真菌是微生物区系的主要成分,并具有较高的生物活性。80年代至今,由于逐渐采用新的研究技术和手段,土壤真菌研究的发展进入了一个新时期。虽然真菌在陆地生态系统中有很重要的作用,但是人们对自然界的真菌多样性了解还很少.受到全球气候变化、环境污染和人类活动等诸多因素的影响,自然环境中真菌的种类和数量、分布都发生了显著的变化.土壤真菌研究越来越受到人们的重视。1土壤真菌多样性1.1物种多样性通常真菌被描述为具有真核,能产生孢子、无叶绿素的有机体,以吸收方式获得营养,普遍以有性和无性两种方式进行繁殖,菌丝通常是由丝状、分枝的枝细胞构成,并典型地被细胞壁所包裹.真正意义的真菌包括四大类群,壶菌门、接合菌门、子囊菌门、担子菌门.已知的壶菌约100属,1000种.最新研究估计全世界的真菌种类约有150万,但至今已被正式描述的只有5%~10%[18~20],绝大多数是未知的.其原因一方面在于对真菌分离培养技术的依赖,不能从少量材料中分离出目标生物,缺少对所有真菌群落生物都适应的培养基和培养条件;另一方面在于对真菌生活环境缺乏全面了解,不能准确地评价不同地域(特别是热带雨林地区)真菌群落的结构组成.1.2生境多样性真菌广泛分布在各种各样的土壤环境中,包括农田、林地、草地、沼泽湿地、温泉热土、冻土层等.由于不同环境因子的影响,使土壤真菌在其生活环境中形成独特的群落种类、组成和分布规律.例如在林地中外生菌根真菌的种类、数量较多,而在草地生态系统中丛枝菌根真菌的分布比较广泛.在一些极端环境,如南北极的冻土层中则分布着丰富的子囊菌门生物,而在温泉热土中则与其他土壤例如林地的优势种类几乎完全不同.一些真菌的生活环境仍然没被完全的报道,真菌能否像细菌一样生活在一些极端环境中?这有待我们进一步去发现新环境中新的种类,并探索其生理机制.1.3功能多样性真菌在土壤生态系统中发挥着多种多样的功能,包括降解纤维素、半纤维素、木质素、胶质、还原氮、溶解磷、螯合金属离子、产生青霉素等一些抗生素等.功能基因多样性又使我们对真菌功能多样性有了更进一步的理解,使我们认识到真菌生物功能的差异是通过功能基因多样性来体现的.科学家通过从纯培养物和环境样品中扩增漆酶基因序列,研究了美国东南部沼泽湿地中有木质素降解潜在功能的子囊菌漆酶序列多样性.独特的序列类型显示出真菌群落中这一功能基因的高度序列多样性.虽然这方面的研究受到许多因素的限制,处于刚刚起步阶段,但不失为我们未来发展的一个方向.2真菌多样性分布影响因子的分析2.1种植年限对真菌多样性的影响蔬菜种植年限对真菌的影响没有一定的规律性，总的说来，棚龄较短的较棚龄长的，土壤真菌的数量和种类都要多，但棚龄超过5a以后，真菌数量显著减少，不过一定周期后土壤真菌的数量又会逐渐增多，但只是少数种类真菌数量的增多，这可能与之适应了土壤环境有关。种植年限对真菌种类的影响与对数量的影响趋势基本相同，到一定年限后，真菌种类呈现减少的趋势。2.2土壤碱解氮对真菌多样性的影响土壤碱解氮含量的高低影响到土壤真菌的种类和数量。随着土壤碱解氮增多，土壤真菌的数量基本呈现出下降趋势，当土壤碱解氮低于50mg/kg时，真菌数量最多，达到29.49×104cfu/g土，高于300mg/kg时，真菌数量最少，仅为17.33×104cfu/g土。当碱解氮含量在100~300mg/kg之间时，真菌的种类最多，分别为44种和35种。2.3土壤有效磷对真菌多样性的影响土壤有效磷含量与土壤真菌的种类和数量之间相关性不大（表5），土壤中有效磷含量在10~50mg/kg之间时，土壤真菌的数量最多，极显著高于其他磷含量土样中的真菌数量。有效磷含量为50~100mg/kg时，真菌种类最多，为46种。而其他磷含量不同的土样中的真菌种类差异不大。2.4土壤速效钾对真菌多样性的影响速效钾含量在250~350mg/kg之间时真菌数量和种类均最多，分别为21.49×104cfu/g土和40种，显著高于其他土样中的真菌的种类和数量。2.5有机肥对真菌多样性的影响随着土壤有机肥含量的升高，土壤真菌的种类和数量也在上升，当有机质高于40g/kg，土壤真菌的种类和数量均最高，分别为22.86×104cfu/g土和55种，经过分析得出，有机肥含量与土壤真菌的数量和种类的相关系数分别为0.976和0.960。2.6土壤含水量对真菌多样性的影响土壤含水量在10%~25%之间适宜真菌的生存和繁殖，在这其间真菌的数量差异不大，土壤含水量过高或过低，真菌数量均明显下降。同样，土壤含水量对真菌种类的影响也如此，土壤含水量在10%~30%之间，土壤真菌种类较多，其中含水量在15%~20%之间真菌种类最多，为50种。2.7土壤质地对真菌多样性的影响土壤质地对真菌的种类和数量影响较大，轻壤土中真菌数量最多，为23.98×104cfu/g土，极显著高于其他类型土壤中的真菌数量。但中壤土真菌种类最多，为68种，其次是轻壤土中的真菌种类，但中壤偏重和砂壤偏轻土壤中真菌种类最少，仅为1种。3关于影响土壤真菌多样性因子的讨论土壤真菌的数量和种类受耕作制度、土壤层次、气候变化及土壤类型等诸多因素影响，轮作与连作对土壤细菌数、真菌数和放线菌数均有较大影响，设施栽培条件下，轮作有利于土壤微生物群落的多样性和稳定性的提高，有利于土壤生态环境的改善。施肥能不同程度地促进或抑制土壤微生物数量，影响根际土壤生理活性，尤其是有机肥能够促进蔬菜根际真菌的繁殖。种植的蔬菜种类也影响土壤真菌的数量和种类。保护地种植年限的延长后，土壤中病原菌如镰孢菌、致病疫霉、链格孢、丝核菌的数量得到累积，一旦发病条件适宜就会造成病害的流行，给蔬菜生产带来巨大的损失。但土传病害的抑制在一定程度上是土壤微生物的群体作用，土壤微生物群落结构越丰富，物种越均匀，多样性越高时，对抗病原菌的综合能力就越强，这也是单一或少数拮抗菌往往难以成功拮抗病原菌的原因之一。由于土壤条件复杂，微生物之间的作用关系微妙，而化学农药的大量施用，又会杀掉许多有益微生物，破坏土壤生态系统平衡，使病害更加猖獗，因此应采取各种农业综合措施，如通过施肥和轮作等来改善土壤条件，调整和优化土壤微生态结构，使土壤中病原菌数目下降到不至于引起作物病害造成经济损失程度。4真菌分类技术在土壤真菌研究中的应用和发展早在数千年前真菌就已被人类认识和利用,但对真菌的系统研究却只有200多年的历史。此间,主要依据形态特征描述和鉴定真菌的属和种,并且在比较形态学的基础上建立了一些分类系统。随着人类整体科学技术水平的不断提高,真菌分类研究技术也得到了不断的发展、完善和补充,大大推动了真菌分类研究的进展。到目前为止,已被描述的真菌约有1万多属,12万多种,而且还不断有新的真菌属、种被陆续发现。4.1传统分类方法经过多代真菌分类学家们200多年的不懈努力,已形成了比较完善的真菌分类体系,对科学研究和生产实践起着重要的指导作用。到目前为止,由以形态学为主的传统分类方法为基础,建立的分类系统在分类学界仍占据着举足轻重的作用,99%的真菌属、种级分类单位仍然是建立在传统分类研究基础上的,并仍在为人类认识真菌物种、了解和利用真菌资源发挥着重要作用。不同真菌分类学家对一些分类特征的认识和理解不同,提出的真菌分类系统就不同。具有较大影响的真菌分类系统有以Ainsworth为代表的分类系统、Hawksworth分类系统、Kirk分类系统、Alexopoulos分类系统及Kendrick分类系统等。上述分类系统都基本上是基于主要形态学为依据的传统分类方法。传统分类方法主要依据真菌的形态、生理和生化特征等对真菌进行分类。尽管传统分类方法有一定的局限性,但是,目前仍是相当有效而且可靠的方法,是大多数分类专家所乐于采用和接受的,仍然是发展其它现代分类方法的重要基础。离开传统分类系统和方法这个基础,真菌分类学就会成为无源之水,无本之木。况且,传统分类方法本身也正处于不断发展和完善的新阶段,并不排除采用分子生物学、生理学、生态学和生物化学等学科的新进展和新方法,来不断地改进和提高真菌分类研究工作。生物分类研究的目的是认识物种和客观地反映其系统演化关系,无论将来的分类系统和方法多么先进,都无法摒弃以简明、节约为主要优点,并在很大程度上反映客观实际的传统分类方法。4.2现代分类技术在土壤真菌研究中的应用传统的分类方法主要依据于真菌的形态特征及细胞生理和生化等特性,尤其是有性生殖阶段的形态特征。其主要困难是,在许多情况下某些真菌的表型性状相对贫乏,难于透过现象认识其遗传本质。许多真菌有性生殖极少发生,难以通过检查生殖隔离来界定物种。近年来多门新兴学科和技术的发展,尤其是分子生物学技术的兴起极大地促进了真菌分类学的发展。一些已经或即将用于真菌分类研究的分子生物学技术指标日渐显示出重要的分类潜能。利用各种分子生物学手段、特殊探针和特定序列鉴定真菌种类是这一领域深入发展的前提和基础。2000年,Muriel等采用非培养条件下,对ITS基因直接扩增,克隆和对ITS区段进行限制性酶切和序列分析的方法尝试检测了土壤真菌的多样性。通过从土壤中直接提取总DNA和从相同的土壤中分离培养真菌、鉴定后提取其DNA两种方法来尝试、对比。从土壤中得到67个真菌分离物,从土壤中提取的总DNA中得到51个扩增子,进行ITS扩增、酶切并比较,共得到了58个ITS-RFLP图谱。可培养真菌与土壤中扩增子的ITS-RFLP图谱差异很大,仅有一种图谱是共有的,其他的都不相同。同样的,培养真菌和土壤中扩增子的ITS序列也差别很大,58个ITS序列同已知序列进行比较,结果显示所有从土壤中分离培养得到的真菌几乎都是子囊菌,只有一种为担子菌,而在土壤总DNA得到的扩增子中,除了大部分为子囊菌外,还有一种担子菌,一种接合菌,和几种分别属于藻物界的卵菌(Oomycota)和原生动物界的根肿菌(Plasmodiophoromycota),可见PCR直接扩增获得的真菌的范围明显广于培养获得的。与传统方法相比,它们可以揭示更多的从未检测到的微生物的多样性,并为理解自然状况下土壤真菌的组成和功能提供更加客观可靠的依据。现代科学技术的发展,尤其是以揭示某些核酸和蛋白质等分子生物学性状来探索真菌的种、属、科、目、纲、门等分类阶元的进化的研究日渐增多,大大开阔和延伸了人们认识真菌遗传本质的视野。现代分类技术主要包括:真菌次生代谢产物的应用、可溶性蛋白质凝胶电泳、同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳[38]、DNA水平上的真菌分类学(DNA中G+Cmol%含量测定、基于聚合酶链反应(PCR)基础上的DNA多态性分析、DNA基因位点的序列分析、多位点酶电泳、脉冲电泳核型分析、DNA-DNA杂交和DNA-rRNA杂交)及数值分类分析等等。土壤真菌中,无性态真菌(半知菌)占很大比重。无性态真菌中又以丝孢纲真菌所占份额最大。由于基本上无法通过生殖隔离试验来测定无性态真菌成员之间