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微免实验整理第1页共11页整理by陆（一）实验一■大吞噬现象、小吞噬现象吞噬功能的测定计数方法：①吞噬百分率:计数100个中性粒细胞中具有吞噬作用的细胞数,即为吞噬百分率。②吞噬指数：观察100个中性粒细胞，计数被吞噬的细菌总数，求平均每个中性粒细胞吞噬的细菌数即为吞噬指数。·大吞噬现象要认识“巨噬细胞”·小吞噬现象主要认识“中性粒细胞”（马蹄状形）（二）实验二■淋巴细胞转化试验（原理、分型、意义）1、原理：T淋巴细胞可以在分裂剂的刺激下，向母细胞转化。促分裂剂能选择性地激发T淋巴细胞合成DNA与细胞分裂。转化百分率正常值为70%左右2、分裂相：即染色体型3、母细胞：较小淋巴细胞大4-5倍；核质疏松呈网状结构，有1-3个核仁；核周透明区；胞浆嗜碱性，有空泡4、过渡型：较小淋巴细胞略大；核质略疏松；着色较淡5、小淋巴细胞：核质致密；着色深；胞浆少6、意义：体外淋巴细胞转化反应，可为测定机体细胞免疫状态的指标之一。■E玫瑰花环实验1、原理：T细胞表面有绵羊红细胞受体，可在自然情况下与绵羊红细胞结合，形成E玫瑰花环，由此可区分T淋巴细胞与B淋巴细胞2、判定结果：凡是淋巴细胞周围围绕4个以上绵羊红细胞者为阳性■血清学反应1、基础：抗原决定簇——抗体的互补决定区微免实验整理第2页共11页整理by陆2、特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性3、抗原抗体反应因素：电解质、温度、酸碱度4、抗原或抗体的检测方法：凝集反应、沉淀反应、免疫标记技术I凝集反应：（直接、间接）概念：抗原+抗体=凝集团块直接凝集：颗粒性抗原+抗体=凝集团块（玻片法、试管法）⑴直接凝集反应——玻片凝集反应①定性；用已知抗体检测颗粒性抗原；细菌的诊断和分型，红细胞ABO鉴定②出现白色凝集块，属于阳性反应⑵直接凝集反应——试管凝集反应（半定量，诊断伤寒副伤寒）间接凝集：可溶性抗原包被于载体+抗体=凝集团块反向间接凝集：抗体包被于载体+抗原=凝集团块协同凝集：抗体结合金葡菌SPA+抗原=凝集团块II沉淀反应：（单项、双向）概念：可溶性抗原+抗体=沉淀物①单向琼脂扩散单向琼脂扩散试验是一种定量试验。将一定量已知抗体混于琼脂中，制板，在适当位置打孔，将抗原加入孔中扩散，与板中抗体相遇，在比例合适处呈现白色沉淀环，环的直径与抗原含量成正比。主要用于测定血清各种Ig和补体成分的含量②双向琼脂扩散可用于分析和鉴定标本中多种抗原成分（抗原、抗体同时扩散（自由、定向）③对流免疫电泳在相应抗原抗体孔之间可见白色沉淀线。④火箭电泳：抗原定量试验（抗体琼脂板、抗原扩散（自由、定向）将一定量已知抗体混于琼脂中，制板，在板的一端打一排小孔，加入待检样品，置于阴极端进行电泳。抗原在泳动过程中与抗体在比例合适部位形成锥形沉淀峰，状如火箭，称火箭电泳。沉淀峰的高低与抗原的浓度成正比。敏感度与单扩相仿，但需时较短。III直接凝集反应—玻片凝集微免实验整理第3页共11页整理by陆（三）实验三■补体结合实验■中和反应实验：（病毒中和实验、毒素中和实验）略■免疫标记技术：1、概念：将已知抗体标记上显示性物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。2、原理：免疫标记技术是在免疫学、生物化学及显微镜术进展的基础上发展起来的一项技术，具有特异、敏感、快速的特点。将荧光色素（常用异硫氰基荧光黄，简称FITC）与特异性抗体（或抗原）以共价键基团牢固结合，但不影响该血清抗体的免疫特性。这种荧光标记的抗原抗体复合物，可通过荧光灯源中产生的紫外光或蓝紫光激发产生荧光，而从荧光显微镜加以观察。3、常用的标记物有：酶、荧光素、放射性同位素、胶体金、生物素、电子致密物等。微免实验整理第4页共11页整理by陆■ELISA（酶联免疫吸附试验）1、原理：把抗原抗体的免疫反应和酶（主要有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）的高效催化作用有机地结合起来，并仍保持其免疫和酶的活性。结合在抗原抗体复合物上的酶在遇到相应的底物时，可以催化底物水解、氧化或还原，从而产生有色的物质。颜色反应的深浅与抗体或抗原的量成正比。2、方法：主要有间接法（用于测抗体）和双抗体夹心法（用于测抗原）。■革兰染色1、意义：对细菌鉴别、选择抗菌药物、研究细菌致病性等有重要意义。2、原理：与细菌细胞壁有关，尚未完全阐明。阴性—红色阳性—蓝色■细菌学总论①细菌是一类具有细胞壁的单细胞微生物，形体微小，一般以微米（µm）作为测量单位。②细菌按其外型可分为球菌、杆菌、螺型菌三大类。③不同种类的细菌大小不一，大多数球菌直径约1µm，杆菌长2∼5µm，宽0.3∼1µm。④细菌的特殊结构：荚膜、鞭毛、芽孢、菌毛【实验】毒力试验：（Elek平板）——鉴定分离出的细菌能否产生外毒素①方法：在含血清的琼脂平板中央贴上一条浸有白喉抗毒素血清的滤纸条，将待检菌垂直划过滤纸条接种②现象：如产生外毒素，则产生白色沉淀线（毒素与抗毒素特异性结合）③本质：抗原抗体沉淀实验【实验】细菌划线分离、药物敏感试验（观察抑菌圈的直径，mm来计数）、抗酸染色方法微免实验整理第5页共11页整理by陆（四）实验四■细菌生长情况（1）液体培养基沉淀生长、混浊生长、表面生长（2）半固体培养基（0.1%~0.3%琼脂粉）混浊生长、线状生长（3）固体培养基（1.4%~2%琼脂粉）菌落、菌苔■细菌变异1、菌落变异（S→R变异）①S型菌落(Smooth)光滑菌落—表面光滑有光泽，边缘整齐。微免实验整理第6页共11页整理by陆②R型菌落(Rough)粗糙菌落—表面粗糙而暗淡，边缘不整齐。③菌落变异是由于菌体本身起变化。一般光滑的细菌有毒力；粗糙的细菌没有毒力或毒力减退。2、鞭毛变异（H→O变异）细菌的鞭毛在某些情况下可以消失而变成没有鞭毛的细菌。■细菌色素①金黄色葡萄球菌产生脂溶性金黄色色素②铜绿假单胞菌（俗称绿脓杆菌）产生水溶性绿色色素■细菌生化反应（五）实验五■化脓性球菌：葡萄球菌（左上）、链球菌（右上）、肺炎球菌（左下）、淋球菌（右下）■甲型（α）乙型（β）丙型（γ）溶血链球菌、肺炎链球菌、淋病奈瑟菌1、甲型α—草绿色，不完全溶血2、乙型β—透明完全溶血3、丙型γ—不溶血4、肺炎链球菌G+（血琼脂平板）（草绿色不完全溶血）5、淋病奈瑟菌G-（巧克力血琼脂平板）6、其中，链球菌的致病：扩散因子（透明质酸酶）使脓液稀释扩散。微免实验整理第7页共11页整理by陆■白喉杆菌G+（亚碲酸钾血琼脂）（Albert染色—异染颗粒）（Elek平板—白喉杆菌毒力试验）{下面图片的Eleck平板写错了，正确是Elek平板}微免实验整理第8页共11页整理by陆■结核杆菌（齐-尼抗酸染色—红色）（罗氏培养基（绿色）—菜花样（黄色）（六）实验六■肥达反应1、概念：用已知的伤寒沙门菌菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原，以及引起副伤寒的甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌H抗原的诊断菌液与受检血清做试管或微孔板凝集实验，测定受检血清中有无相应抗体及其效价的试验。2、结果判断：微免实验整理第9页共11页整理by陆3、【实验】血清学诊断：肥达反应①原理：用已知伤寒沙门菌的O、H抗原、甲、乙副伤寒沙门菌的H抗原与患者血清做定量凝聚试验，根据抗体效价的增长，辅助肠热症的临床诊断。②用途：辅助诊断伤寒、副伤寒【带菌者检查：Vi抗体】【实验】·方法：试管凝集法（定量）当TO≥1：80，TH≥1：160，PA、PB均≥1：80才有意义·动态观察：双份血清抗体四倍升高有诊断意义·临床意义：辅助诊断伤寒和副伤寒·O抗体（IgM），H抗体（IgG）*O、H抗体均升高，患伤寒的可能性大*O、H抗体不升高，患伤寒的可能性小*只有H升高，则可能是预防接种过或非特异性回忆反应，*只有O升高而H不高，则可能是感染早期或其他沙门菌的交叉反应。·分析结果时应注意：①正常人抗体水平。一般伤寒杆菌O抗体效价在1：80以上，H抗体效价在1：160以上，甲、乙副伤寒杆菌H抗体效价在1：80以上才有诊断价值；②动态观察：一般随病程延长第2次检测抗体效价比第1次高4倍或4倍以上才有诊断意义。③区别H、O抗体增高的意义：两者同时升高有辅助诊断意义；两者同时低于正常无意义；O抗体效价高而H抗体效价低，可能是感染的早期或其他沙门菌感染引起的交叉反应。若H抗体效价高而O抗体效价在正常范围内，则可能是以往接种过疫苗或非特异性回忆反应所致。■肠道杆菌G-（SS、双糖培养基）■生化反应表微免实验整理第10页共11页整理by陆■炭疽杆菌G+（普通琼脂培养基）（灰白色粗糙型菌落）（卷发状边缘）■霍乱弧菌G-（碱性蛋白胨水）■厌氧芽孢梭菌（破伤风、产气荚膜、肉毒梭菌）1.破伤风梭菌G+（庖肉培养基）（毒素动物实验）2.产气荚膜梭菌G+（庖肉培养基）（血琼脂平板—双层溶血环）（高层琼脂断裂试验）（汹涌发酵试验）3.肉毒梭菌G+（庖肉培养基）（血琼脂平板—完全溶血）微免实验整理第11页共11页整理by陆■产气荚膜梭菌【G+，侵袭性很强】【实验】培养特性：①血琼脂平板上，双层溶血环（靶样溶血）；——内环β溶血，外环α溶血（内环是由θ毒素引起的较窄的透明溶血环，外环是由α毒素引起的不完全溶血环）②蛋黄琼脂平板上，有Nagler反应现象；——菌落周围出现乳白色浑浊圈，是由于α毒素分解卵磷脂所致；③代谢活跃，分解多种糖类，产生大量气体——疱肉培养基培养，可分解肉渣中糖类产气，肉渣呈淡红色④牛奶培养基中，可出现“汹涌发酵”——该菌分解乳糖产酸，使牛奶中的酪蛋白凝固，产生大量气体冲散酪蛋白，并将封固液面的凡士林层顶开，甚至冲掉试管口棉塞（七）实验七■白色念珠菌G+（白假丝酵母菌）（普通琼脂、沙保培养基）可见酵母样细胞伴假菌丝。■新型隐球菌（血琼脂、沙保培养基）（墨汁负染）可见圆形菌体及荚膜、芽生孢子。■病毒的致细胞病变作用（CPE）许多病毒在细胞内复制增中，由于干扰细胞的正常代谢和损伤细胞结构，引起细胞形态的变化，如细胞皱缩、出现空泡、斑块、融合、变圆或坏死的现象，此种在光学显微镜下可观测到现象称病毒的致细胞病变作用（cytopathiceffect，CPE）■包涵体胞浆、胞核内出现的圆形或椭圆形、嗜酸或嗜碱性的小体狂犬病毒包涵体—内基小体