微生物代谢工程

微生物代谢工程1.代谢控制发酵代谢控制发酵就是利用遗传学的方法或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使得目的产物大量的生成、积累的发酵。代谢控制发酵的核心：解除微生物代谢控制机制，打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。2.微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段定义：应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。简而言之，代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的的修饰。研究内容：(1)代谢流的定量和定向(2)细胞对底物的吸收和产品的释放模型及分析(3)研究胞内代谢物浓度的反应工程方法(4)用13C标记实验进行胞内稳态流分析研究手段(1)采用遗传学手段的遗传操作①基因工程技术的应用。②常规诱变技术的应用。(2)生物合成途径的代谢调控①生物合成中间产物的定量生物测定。②共合成法在生物合成中的应用。③酶的诱导合成和分解代谢产物阻遏。④无机磷对生物合成的调节。(3)研究生物合成机制的常用方法①刺激实验法。②同位素示踪法。③洗涤菌丝悬浮法。④无细胞抽提法。⑤遗传特性诱变法。3.工业发酵的五字策略（图示加文字说明）①进，在育种和发酵控制方面都要促进细胞对碳源营养物质的吸收；②通，在育种方面解除对某些酶的反馈调节，在发酵控制方面，诱导这些酶的合成或激活这些酶，从而使来自各代谢物流（除碳架物流外海包括其他支持生物合成的物流）能够畅通的注入载流途径，汇入代谢主流，流向目的产物，特别是当发酵进入目的产物合成阶段后，必需确保载流路径通畅，代谢主流优势明显③节，采用育种或发酵控制手段，节制与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物。这里所谓的“节制”是指封闭或削弱以目的产物合成途径的起始底物或以中间产物为起始底物的分支途径；④堵，采用育种或发酵手段消除或削弱目的产物进一步代谢的途径，包括目的产物参与的分解代谢和合成代谢，为了消除或削弱目的产物的进一步分解代谢，就必须降解目的产物进一步代谢的酶活力或酶量，甚至使这些酶不再合成或不起作用；⑤出，促进目的产物向胞外空间分泌。在育种和发酵控制发面可通过调节细胞对目的产物的通透性，增加输送目的产物的载体蛋白的量，为目的产物输送代谢能的方法，使目的产物尽快转移出细胞。4.酶的阻遏机制，以大肠杆菌色氨酸或组氨酸操纵子为例来说明（图示加文字说明）终端产物对其自身合成途径的酶的合成的反馈阻遏和弱化的机制反馈阻遏：组氨酸操纵子：与His降解代谢有关的两组酶类被称为hut酶，控制这些酶合成的操纵子被称为hutoperon。由一个多重调节的操纵子控制，有两个启动子，两个操纵区及两个正调节蛋白。Hut操纵子共编码4种酶和一个阻遏物。4种酶分别由hutG，hutH，hutI及hutU基因编码，阻遏物则由hutC基因编码。在产气克氏菌中，以上基因构成两个转录单位，hutI，hutG和hutU，hutH分别被转录合成两条mRNA长链。这两个转录单位各自都有一个启动子和一个操纵区，其转录过程都是从左向右进行的，hutC阻遏物能与每个操纵区相结合。无论以组氨酸作为唯一碳源或氮源，hut操纵子都会处于有活性状态。Hut操纵子的每一个启动子上都有cAMP-CAP结合位点，当碳供应匮乏时，能合成cAMP，出现cAMP-CAP复合物，并与操纵区上的相应位点结合，诱发基因转录。5.协同反馈抑制，以谷氨酸产生菌（棒杆菌或短杆菌）天冬氨酸族氨基酸代谢途径中反馈调节为例来说明（图示加文字说明）上图为谷氨酸棒杆菌中天门冬氨酸族氨基酸合成过程中的终产物的协同（反馈）抑制机理。协同反馈抑制是指在分支代谢途径中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，若某一末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用的现象。天门冬氨酸族氨基酸合成起始于天冬氨酸，经过两个分支最终合成终产物赖氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸，而终产物中赖氨酸和苏氨酸协同起来对该途径第一步中的酶天门冬氨酸激酶具有抑制作用，这既为天冬氨酸族氨基酸代谢途径中协同反馈抑制。6.营养缺陷型和结构类似物抗性突变株（以赖氨酸产生菌为例）如何选育获得(1)营养缺陷型突变株的选育营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。完全培养基(CM)是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。补充培养基（SM）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。营养缺陷型的筛选一般要经过以下四个环节。第一步，诱变剂处理。第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。第三步，检出缺陷型：具体方法很多。用一个培养皿即可检出的，有夹层培养法和限量补充培养法；在不同培养皿上分别进行对照和检出的，有逐个检出法和影印接种法。可根据实验要求和实验室具体条件加以选用。第四步，鉴定缺陷型：可借生长谱法进行。生长谱法是指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物，视某营养物的周围有否长菌来确定该供试菌的营养要求的一种快速、直观的方法。(2)结构类似物抗性突变株的选育过程①确定结构类似物②进行生长抑制试验和敏感性试验③设计“筛子”a.根据反馈调节机制设计b.同时要考虑协同调节机制等c.要考虑实验的成本问题d.根据问题多的轻重缓急设计④确定结构类似物剂量⑤确定筛选的具体方法a.浓度梯度平板筛选法b.纸片法c.液体培养浓缩后涂布的方法⑥高产株的检出a.反馈调节的调节突变株：抗性b.输送体系突变株：抗性c.影响与底物的亲和能力的突变株：超敏性d.对入围的突变株进行产量形状的筛选7.以初级代谢产物乙醇（利用包括葡萄糖等各种原料）或1，3—丙二醇为例，简述微生物代谢设计育种方案答：以代谢产物为乙醇为例(1)代谢育种方案的设计许多细菌、真菌和高等植物中都存在由丙酮酸生成乙醇的途径，它为厌氧条件下的糖酵解途径起着再生NAD+的重要作用。其中，丙酮酸脱羧酶(PDC)催化丙酮酸的非氧化脱羧反应，形成二氧化碳和乙醛；后者在乙醇脱氢酶(ADH)的作用下转变为乙醇。由于丙酮酸在糖酵解途径中是个关键的节点，与草酰乙酸、乙酰辅酶A、乳酸等合成途径均有密切联系，因此可以采用工业发酵的五字策略，通过强化表达细胞内PDC和ADH的活性来扩增目标途径，阻断副产物的形成路线，解除乙醇生物合成的代谢阻遏作用来提高菌株乙醇产量。(2)代谢育种方案的实施①菌种选定使用嗜温或嗜热性的梭菌属由纤维素类物质直接厌氧发酵乙醇，是生物能源再生的一种理想选择，其优点为代谢速率快，最终产物回收率高，细胞和酶系稳定，并能直接转化纤维素或戊糖。②遗传操作方案的制定这类细菌用于工业规模的乙醇发酵也存在两大缺陷：在乙醇发酵过程中往往伴有乙酸和丁酸等副产物的产生，而且最终产物的最高积累浓度仅为3％左右，由此则采用分子生物学方法对菌株进行改进以提高乙醇产量。③遗传操作方案的实施利用DNA重组技术重新设计糖酵解途径，阻断副产物的形成路线，解除乙醇生物合成的代谢阻遏作用，同时提高细胞对高浓度乙醇的耐受性，是高产乙醇梭菌属工程菌构建的主要内容。④变异株培养条件的优化对变异株培养条件的进行优化，优化时尽量从生物学的角度安排试验，尽量排除培养基消毒、摇瓶培养条件不一致带来的系统误差，每批摇瓶试验都要做对照，注重产量与菌体量之间的的微妙关系。8.如何采用代谢工程进行氨基酸（如赖氨酸或苏氨酸）育种？答：以苏氨酸产生菌育种为例(1)代谢育种方案的设计中心代谢流上节点的分析：在谷氨酸棒杆菌中，存在着由L-天门冬氨酸为起点产生L-苏氨酸和L-异亮氨酸的生物合成途径，整个途径含有两大节点：即由L-丁氨醛酸合成L-赖氨酸或高丝氨酸，以及由高丝氨酸合成L-蛋氨酸或L-苏氨酸直至L-异亮氨酸。前一节点两条途径的代谢流选择由高丝氨酸脱氢酶(HD)和二氢吡啶羧酸合成酶对其共同底物丁氨醛酸的相对亲和性控制，这两个酶的编码基因分别为hom和dapA。在正常情况下，HD的底物亲和性以及转化率是其竞争对手二氢吡啶羧酸合成酶的25倍，因此碳源主要流向苏氨酸-蛋氨酸生物合成途径。但当产生菌细胞内苏氨酸大量积累时，由于HD对L-苏氨酸的变构抑制作用极为敏感，导致丁氨醛酸优先进入赖氨酸生物合成途径。理想载流途径的推定：谷氨酸棒杆菌的HD和高丝氨酸激酶(HK)由hom-thrB操纵子编码，在hom编码序列上游邻近区域存在一个单一的启动子，L-蛋氨酸的阻遏作用可使这个启动子介导的操纵子转录水平降低3倍。此外，在操纵子mRNA的转录起始位点与翻译起始密码子之间还存在着一个衰减子结构。为此根据L-苏氨酸和L-异亮氨酸的生物合成途径，采用工业发酵的五字策略，主要通过阻塞与目的产物L-苏氨酸的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物，以及消除或削弱目的产物进一步代谢的途径的方法提高L-苏氨酸的产量。(2)代谢育种方案的实施①菌种选定谷氨酸棒状杆菌，优点：工业中以广泛应用的菌株。②遗传操作方案的制定与实施提高野生型hom基因编码产物HD的表达水平，缓和由于苏氨酸变构抑制作用而导致的酶活降低程度，或者直接用homdr突变基因代替生产菌中的野生型hom基因。在homdr出突变株中，同时克隆表达thrB和thrC基因，但转化子在苏氨酸的合成能力上并没有新的突破。克隆表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。该酶催化反应的产物为草酰乙酸，它是L-天冬氨酸生物合成的前体，因此草酰乙酸的大量积累有助于L-天冬氨酸类氨基酸合成产率的提高。苏氨酸合成的显著流分被转化成异亮氨酸或者进一步降解为甘氨酸。苏氨酸向异亮氨酸的转化可通过同源交换构建ilvA突变株而抑制，而阻断苏氨酸到甘氨酸的降解途径则是个具有挑战性的难题，涉及到多个途径，而且有关的基因在棒状杆菌中尚未被鉴定。③变异株培养条件的优化对变异株培养条件的进行优化，优化时尽量从生物学的角度安排试验，尽量排除培养基消毒、摇瓶培养条件不一致带来的系统误差，每批摇瓶试验都要做对照，注重产量与菌体量之间的的微妙关系。9.氨基酸生物合成的代谢流量分析涉及到哪几方面的内容？除了代谢途径及其调节机制和已知途径的化学计量分析以外，稳态代谢流量和流量动力学分析对于理解氨基酸生产的代谢网络也越来越重要。这涉及到提供碳架物质、氧化还原当量和代谢能的中心代谢途径，也涉及到那些通往特定氨基酸的合成代谢途径。代谢流量分析和代谢流的动力学分析的一个主要目的在于鉴定代谢网络中所一般认为的限速步骤。10.由于我国人多地少，在不争或少争口粮的前提下，如何建成1~2个绿色大庆？利用生物质能源生产乙醇作为燃料木质纤维素类物质的来源却极其丰富且廉价，由于它不能被人体消化，因此不能用做食品工业的原料，也很难被转化为发酵用的葡萄糖。木质纤维素类物质之所以被认为是乙醇燃料生产的合适原材料，其原因还在于它可由生长期较短的木材、农业和林业的废料(如作物秸秆和树枝树叶)，以及各类废弃物(如腐烂物、废纸和市政固体垃圾)获得。我国可以用于生物质能源生产的植物和原料很多，如糖质原料(甘蔗、甜菜等)、淀粉(玉米、小麦、薯类等)，目前已用于燃料乙醇的生产，以这些原料生产的燃料乙醇能力已达300万吨左右。充分利用现有土地与技术，生产的生物质可转化5000万吨酒精，接近两个大庆的能源当量。燃料乙醇原料生产既可使用玉米、小麦、薯类、秸秆等现成的农产品，又可专门种植一些原料。利用发酵法利用木质纤维素生产乙醇的菌株可通过以下方法获得①酵母菌属乙醇发酵途径的改良利用基因重组工程技术改良酵母菌属乙醇发酵过程使酵母菌能够有效地将木糖和葡萄糖转化为乙醇，而且这些克隆的木糖代谢基因的