微生物学诊断

1.沙门氏菌的微生物学诊断过程分述如下：1）病料采集、处理:未污染病料直接接种普通琼脂、血琼脂或鉴别培养基平板分离细菌；污染材料如饮水、粪便、饲料、肠内容物和已败坏组织等，常需要增菌培养基如亮绿-胆盐-四硫磺酸钠肉汤等增菌后再行分离。这些培养基能抑制其他杂菌生长而有利于沙门氏菌大量繁殖。接种后于37℃培养12-24-48h。2）肠道菌鉴别培养基中的培养:蘸取上述增菌培养物在SS培养基中划线分离，经37℃培养24h。若观察到其中长出黑色或黄色菌落，则视为可疑菌落；3）可疑菌落接种三糖铁培养基：挑取上述SS平板中的可疑菌落作成纯培养，病同时在三糖铁培养基斜面和底层穿刺，37℃培养24h。如观察到在三糖铁琼脂底层呈黄色，或黑色，斜面上为红色，则进一步判定疑似为沙门氏菌；4)纯培养物的形态学检查和系统生化项目鉴定：将上述疑为沙门氏菌的培养物涂片，经革兰氏染色，镜检；同时接种于各种生化培养基中培养，以鉴定其生化特性；)5)纯培养物的血清学鉴定（属和型）:同时可将三糖铁上的培养物与沙门氏菌A-F组多价抗0血清及各单因子血清做玻板凝集试验，以鉴定其属、型抗原；6）确诊报告：综合上述各项检测结果对此病例做出确诊。2.炭疽杆菌的微生物学诊断过程分述如下：1）病料采集：(疑似)死于炭疽的病畜尸体严禁剖检；要在动物尸体末梢循环处采血或切开肋间采集脾脏，切口烙封或用浸泡消毒药水的纱布填塞；2）细菌学检查a.形态学检查:上述病料涂(触)片，干燥、固定后，以碱性美兰或瑞氏或姬姆萨染色法结合革兰氏染色，如发现有荚膜的竹节状链杆菌，革兰氏染色呈阳性的两端平截的链杆菌时，结合流行病学、临床症状即可做出初步诊断；b.病料分离培养:可选用普通琼脂平板、血琼脂平板及普通肉汤对上述病料进行分离培养。如在普通平板上分离出扁平、灰白色不透明、干燥、无光泽、边缘不整齐，低倍镜或放大镜观察边缘呈卷发状的大菌落时，则为疑似菌落。挑取此疑似菌落接种于营养肉汤中进行培养，观察其是否具有炭疽杆菌肉汤培养物的生长性状。必要时还可用分离菌的纯培养物做串珠试验及明胶穿刺培养。c.动物接种试验:取上述分离菌的肉汤培养物或将病料用灭菌生理盐水制成1:5悬液，皮下注射小鼠，小鼠常于注射后24-36h死于败血症，剖检可见注射部位胶样浸润，脾肿大等病变；取血液、脏器等涂片、镜检，如发现竹节状有荚膜的链杆菌，结合上述各项检查结果，即可做出确诊。3）血清学检查对于不能进行细菌学检验的病料如皮毛等可进行血清学诊断。a.阿(Ascoli)氏热沉淀试验:将病兽皮革或尸体组织切碎后，加水煮沸过滤，取滤液滴加于小管内的免疫血清面上，室温或37℃放置十分钟后，如见两液接触面出现白色沉淀环，即为阳性，证明滤液中有炭疽杆菌的多糖质抗原。b.琼扩试验也可用上述待检抗原及标准免疫血清做琼扩试验，若观察到免疫血清孔和待检抗原孔之见出现白色沉淀线，即为阳性，证明滤液中有炭疽杆菌抗原。4）确诊报告根据上述各项诊断结果，判定该动物感染了炭疽或此兽皮中污染了炭疽杆菌。3.致病性大肠杆菌的微生物学诊断的内容和步骤分述如下；1)病料采集、处理及分离培养:对败血症病例，可无菌采集其病变的内脏组织；直接接种在血琼脂或麦康凯培养基平板中分离细菌；对幼畜腹泻及猪水肿病病例应采集器肠内容物或黏膜刮取物以及相应肠段的肠系膜淋巴结，分别接种于麦康凯琼脂及血琼脂培养基中于37℃培养24-48h后，如观察到在麦康凯培养基中长出红色菌落或在血平板上菌落周围呈β溶血(仔猪黄痢与水肿病菌株)，则视为可疑菌落。2)可疑菌落接种三糖铁培养基：挑取上述可疑菌落在普通琼脂斜面做纯培养，并同时在三糖铁培养基斜面和底层穿刺，37℃培养24h，做初步生化鉴定。如观察到在三糖铁琼脂底层呈黄色，斜面上为黄色或红色，则进一步判定疑似为大肠杆菌；3）纯培养物的形态学检查和系统生化项目鉴定：将上述三糖铁反应模式符合大肠杆菌的培养物或其纯培养涂片，经革兰氏染色，镜检；同时接种于各种生化培养基中培养，以鉴定其生化特性；4)分离菌株的毒力因子鉴定：对幼畜腹泻及猪水肿病病例分离菌要分别鉴定其肠毒素、水肿毒素及黏附素抗原等毒力因子；5)纯培养物的血清学鉴定（属和型）:同时可将分离菌株的培养物与大肠杆菌标准抗O、K及H因子血清做玻板凝集试验，以鉴定其O、K及H抗原,以鉴定出其血清型；6）确诊报告：综合上述各项检测结果对此病例做出确诊。4.叙述巴氏杆菌的微生物学诊断如下：1）主要进行细菌学诊断，在此基础上，必要时可进行血清学检查；2）病料采集、处理：可采取血液、渗出液，肝脏等实质脏器作为待检病料。3）病料涂片、染色、镜检：将病料涂片，经干燥、固定后，用革兰氏结合美兰或瑞氏染色法染色后镜检，如革兰氏染色镜下为阴性的短小杆菌；美兰或瑞氏染色呈现两极浓染，结合流行病学、临床症状和剖检变化，则可怀疑为巴氏杆菌，即可作出初步疑似诊断。4）病料分离培养：将病料无菌接种于鲜血琼脂中。37℃培养24h后，如观察到淡灰色、圆形、湿润、露珠样不溶血的小菌落，则为可疑菌落。无菌挑取此可疑菌落作革兰氏或美兰染色如为革兰氏阴性、美兰染色呈两极浓染的短小杆菌，结合病料涂片镜检的结果，即可作出进一步诊断。5）动物接种试验：如要检测该分离细菌的致病性(毒力)，则可选小鼠、家兔或鸽进行接种，以观察其有无致病性即毒力。如实验动物发病死亡，则可对其进行剖检，观察其病变，并无菌采集实验动物病料进行形态学检查及分离培养，将其检查结果和上述直接用病料进行检查的结果相比较，如一致则可确诊。6）血清学试验：若要鉴定分离菌的荚膜抗原或菌体抗原，则要用巴氏杆菌抗血清进行血清学试验。7）确诊报告：结合上述各项检测结果，即可作出最后的确诊：该分离菌为引起此次疾病的病原菌。