微生物实验器材与基本操作.

微生物实验器材与基本操作内容实验室的基本设备培养器皿准备培养基的制备灭菌与消毒微生物的无菌操作与检查实验室的基本设备玻璃试管管壁必须较厚，没有翻口接种工具培养皿的准备（一）清洗(清洁的玻璃器皿是得到正确实验结果的重要条件之一）目的：除污垢（灰尘、油污、无机盐）洗涤剂：洗衣粉洗洁精玻璃仪器的清洗新购买的玻璃器皿的清洗（表面附有游离的碱性物质）比色皿的清洗不可用强碱，也不可用超声清洗用洗液浸泡，再用自来水冲洗，应内外不挂水珠使用过的玻璃器皿的清洗一般玻璃器皿染菌的玻璃器皿121℃高压蒸汽灭菌，20~30min染菌的移液管使用后立即放入5%石炭酸溶液中浸泡数小时塑料器皿的清洗硅胶塞：新购置的硅胶塞带有带量的滑石粉，用自来水冲洗，再用2%NaOH溶液煮10~20min。再用自来水冲洗，然后再用5%盐酸溶液浸泡30min，最后再用自来水冲洗。含有琼脂培养基的玻璃器皿用玻璃棒将琼脂培养基刮下琼脂培养基已干燥将器皿放入少量的水中煮沸，使琼脂熔化后趁热倒出洗涤后培养皿的放置（二）包扎（1）培养皿的包扎洗净晾干后的培养皿，用旧报纸包扎，每包6—10套。（2）吸管的包扎（3）试管的包扎塞上合适的试管塞（塞子的1/2~1/3进入试管），然后7—10支一捆用报纸包扎，灭菌。（4）试剂瓶的包扎用报纸或牛皮纸包扎后，灭菌。（5）三角瓶的包扎塞上合适的试管的塞，或盖上8层纱布，外加一层报纸，用棉绳包扎后灭菌。（6）吸头和Eppendorf管吸头根据不同的规格戴手套加入不同的盒子；Ed管放入饭盒中，灭菌，50°烘干后备用。培养基的制备按物理状态分：液体培养基固体培养基1.5%—2%凝固剂半固体培养基少量凝固剂（0.2%—0.7%）常用培养基成分一般细菌牛肉膏蛋白胨培养基：真菌马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：放线菌高氏1号培养基：霉菌查氏培养基：酵母菌（1）PDA（2）麦芽汁培养基（3）豆汁葡萄糖培养基（4）YPD培养基1%YeastExtract（酵母膏）2%Peptone（蛋白胨）2%Dextrose(glucose)（葡萄糖）若制固体培养基，加入2%琼脂粉（一）液体培养基的配制1、称量2、溶解加水至总容积的4/5左右，慢慢搅拌使其溶解。如有需要，可加热。3、调PH培养基溶解均匀并冷却至室温用PH试纸测PH，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液调节PH。（缓慢少量多加搅拌）再加水到所需的量。4、分装分装于三角瓶时，分装量不得超过容积的1/2。5、封口瓶口处盖上6~8层纱布，瓶口布外包一层牛皮纸或两层报纸，用棉绳捆绑。6、灭菌做好标记，放入高压灭菌锅中120℃，20min7、冷却后接种（二）平板培养基的配制1、称量按比例称取一定量的琼脂粉（1.5%—2%），放入三角瓶中。2、按液体培养基的配制1~3步操作，调好PH，定容3、分装分装量不得超过三角瓶的1/24、封口6~8层纱布，再外包一层牛皮纸或两层报纸5、灭菌做好标记，高压灭菌锅中120℃，20min6、冷却放入55℃烘箱或水浴中，温度降至55℃，进入无菌室倒平板。7、倒平板在超净台的酒精灯火焰旁的无菌区内进行操作，右手那装有培养基的三角瓶，拔出试管塞；左手将培养皿的盖在酒精灯火焰旁打开一条缝，让三角瓶口深入；倒入培养基，盖好后顺着超净台边缘将平板推入，平放在超净台上。8、倒置冷却至培养基凝固后，倒置平板，装入保鲜袋中扎好，放入4℃冰箱中保存备用。（三）斜面培养基的配制1、按液体培养基配制1~3步操作，调好PH，定容2、称量称取1.5%~2%的琼脂粉，加入已溶解的药品中，再熔化琼脂（控制火力，防止培养基溢出，不断搅拌），最后补足所失的水分。3、分装趁热分装于试管内，分装量不超过高度的1/5~1/4，不要污染试管塞。4、灭菌加试管塞，7支成一捆，试管塞外包一层牛皮纸，或两层报纸，贴上标签。高压蒸汽锅中121℃，20min。5、摆斜面温度降至55℃左右，将灭菌后的斜面培养基，趁热放于玻璃棒或移液管上，调整斜度，培养基的斜面不超过试管长度的1/2。6、保存冷却后，装入保鲜袋中扎好，置于4℃冰箱中。（四）半固体培养基的配制1、称量称取0.7%左右的琼脂粉2、同固体培养基相同（五）无菌水的准备1、100ml三角瓶（装有玻璃珠），装双蒸水45ml2、试管装4.5ml双蒸水3、塞上管塞或盖上塑料盖子4、包扎、灭菌5、备用注意事项1、药匙不要混用2、PH：(1)调PH要逐步滴加，勿使过酸过碱，破坏培养基中的某些成分，防止回调或反复调整PH。（2）灭菌后PH会发生改变，要注意检测灭菌后的PH状况。（较特殊的用于确定最适PH，最值PH）3、琼脂：待液体培养基煮沸后，再加入琼脂。4、分装：避免培养基粘到管口或瓶口，如不小心粘上，应立即擦干净。5、制斜面和平板的培养基：温度不宜太高，一般60℃左右。6、试管塞：1/2~2/3进入试管内。7、液体培养：三角瓶内的培养基量一般为1/5~1/3,不应超过容积的1/2。8、斜面培养：培养基装量为试管高度的1/5~1/4，灭菌后制成的斜面长度不超过1/2。9、半固体培养：培养基为试管高度的1/3,灭菌后垂直待凝。10、平板：100ml5~6个平板一个平板大约15~20ml培养基，铺满皿底高1.5~2mm灭菌与消毒灭菌采用强烈的理化因素，使微生物永远失去其生长繁殖的能力，如121℃高压灭菌20min。消毒采用一种较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌。如用70%酒精进行皮肤表面的消毒。防腐利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，防止食品发生霉腐。物理消毒灭菌1、干热灭菌法原理：细胞内蛋白质凝固变性方法：火焰灼烧灭菌&热空气灭菌特点：温度高160℃~180℃，2h2、湿热灭菌法原理:高温使原生质中的蛋白质凝固变性，破坏酶的活性。方法：高压蒸汽灭菌法3、紫外线灭菌法原理：（1）诱导胸腺嘧啶二聚体形成，抑制DNA复制；（2）辐射使O2电离为[O]，然后形成O3，或是水形成H2O2；缺点：杀菌能力较强，但穿透力弱，一张薄纸，玻璃或水层就可滤过大部分的紫外线。对象：空气和表面杀菌4、过滤除菌原理：通过机械作用滤去液体或其气体中的细菌。对象：不能采用加热灭菌的物质，如维生素、血清、抗生素、酶液等缺点：滤量有限，只适用于实验室小量溶液（20ml以下）的过滤除菌。5、化学药剂消毒灭菌高压蒸汽灭菌法1、在高压锅内加入一定量的水，将包扎好的物品放入物品框中。2、接通电源，进行加热。3、将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压强升到0.5kg/cm2时，再打开排气阀，待压强回到0时关闭排气阀。4、压强达到1kg/cm2时，灭菌锅内的温度为121℃，维持20~30min。5、灭菌时间一到，切断电源，待压强降至0打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。注意事项1、加上锅底水，防止干烧；2、锅内物品之间留有缝隙，利于蒸汽穿透；3、物品放置不宜过多，过挤，锅内应留出三分之一空间。以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。4、三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。5、尽可能排出锅内冷空气；6、灭菌结束后，要缓慢放气降压（尤其是液体培养基灭菌），切勿突然打开排气阀降压，会引起瓶子爆破或培养基沸腾冲出容器，污染试管塞，瓶口布。微生物的无菌操作实验前无菌室的紫外线杀菌注意事项1、操作区消毒：无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用70酒精擦洗，然后紫外线消毒30min。2、消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。3、实验用品，如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台，同时紫外线消毒。4、操作：开启无菌操作台风机运转10分钟后，才可开始实验操作，动作要准确敏捷，但又不能太快，幅度不能太大，以防空气流动，增加污染机会。5、必要物品，如试管架，移液器或吸管头等可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通。6、实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。7、为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。8、工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。9、实验结束后，将实验物品带出工作台，如需要继续进行下一个实验，则用70%酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10分钟后，才可进行下一个实验操作。倒平板涂棒涂布1、超净台上酒精灯旁，取0.1~0.2ml，加到凝固好的培养基上。2、涂棒浸入酒精中，取出后在火焰上过一下，点燃酒精后，离开火焰。3、等涂棒上酒精燃烧完毕后，在火焰边上，涂棒在培养皿内侧稍做停留。4、涂棒放在平板上不接触细胞的地方进一步冷却。5、在平板上缓慢旋转涂布细胞，使其分散均匀。（不可将涂棒往下压，利用涂棒自身重力产生压力）6、涂布完毕后，适当的温度（如25~37℃）下倒置培养。接种环接种1、接种环在酒精灯外焰上充分烧红，金属棒部分转动着通过火焰3次。2、火焰边上打开菌种试管或培养皿，培养基上或玻璃管壁上稍作冷却。3、挑取菌体，迅速接到新的培养基上。4、接种环通过火焰烧红灭菌，还原。5、适当条件下培养移液器接种1、将移液器容量调到所需数值，竖直装上合适吸头。2、酒精灯旁，左手拿培养液，右手小指与手掌夹住培养液的盖子、打开培养液的盖子，洗去一定量的样品，盖回盖子。3、在酒精灯旁，将样品接种到试管或三角瓶中。4、轻轻混匀，放入合适温度的摇床或培养箱中培养，摇床记得调转速。注意事项1、接完后灼烧时，先将近环处镍丝置于火焰中，是热导向接种环。如果直接烧灼，环上残余的菌液会因突然受高温而爆裂四溅。2、沾有酒精的涂棒只需在火焰上过一下，一旦酒精点燃后，就离开火焰。3、涂布平板法所用的菌液量为50~200ul，不可太多。4、小心取无菌实验物品，避免造成污染。（勿碰触吸管、吸头的尖头部或容器瓶口，也不要在打开的容器上方操作实验。）5、尽量不要将瓶盖盖口朝上放置于桌面。