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微生物发酵肽的分离与提取(豆粕发酵制备大豆肽的研究)摘要：大豆肽是指将大豆蛋白水解成3个氨基酸的多肽，分子量在1000Da左右。以豆粕为原料。采用发酵法生产大豆肽，通过微生物作用对某些苦味肽基团进行修饰和重组，使小肤之间、小肽与氨基酸之间发生移接、重排．制得的大豆肽具有较好的生理特性和加工特性，克服了酶解法产品苦味大和1：2感差等缺点，产品广泛用于食品、医药工业。关键词：大豆肽；发酵；大豆蛋白；蛋白酶1引言1.1大豆肽的功能特性大豆多肽是以大豆为基本原料．通过现代生物技术将大豆球蛋白转化为小分子肽。小分子大豆多肽不仅有很好的溶解性、低粘度、抗凝胶形成性，而且在体内消化吸收快．2～3个氨基酸组成的低肽比游离氨基酸有更好的吸收性能．能够完整地通过肠道吸收，作为生物活性肽在组织水平上引起机体的生物学效应。大豆肽蛋白质利用率高，还具有低抗原性．不会产生过敏反应。此外还具有能促进肌红细胞复原，促进脂肪代谢等生理活性。大豆肽克服了大豆蛋白质在营养学上的弱点．具有比大豆蛋白质更丰富的营养和功能特性．是一种极具潜力的功能性食品基料。1.2大豆肽的生产大豆肽的生产主要有酶解法和微生物发酵法。酶解法具有产品安全性高、生产条件温和、水解易控制、可定位生产特定的大豆肽等优点，但其缺点是大豆蛋白利用率不高．仅限于少数几种微生物蛋白酶、动物蛋白酶和植物蛋白酶，酶解产肽率相对较低．而且成本高．肽酶价格和脱苦成本都相应增加生产成本。目前研究者正探索豆粕发酵生产大豆肽，其中菌种用于产蛋白酶的黑曲霉。活性微生物菌体直接参与生化代谢，作用于大分子大豆蛋白，修饰某些功能基团；活性微生物菌体可以合成、分泌小肽物质，发酵液蛋白水解度较高，大豆肽收率高，而且风味、色泽等感官特性均优于酶法水解的产物。另外，应用微生物直接脱苦效果好，很有发展前景。黑霉菌的内源酶中存在着广泛的肽酶谱系，且价格低廉、来源广泛，很有发展前景。2发酵大豆多肽及其功能研究2.1材料枯草杆菌购于典型培养物保藏中心，经驯化处理保存于微生物实验室；酵母菌从安琪活性干酵母中分离，保存于微生物实验室。营养琼脂培养基：牛肉膏(3克)，蛋白胨(10克)，NaCl(5克),琼脂（15-20克），加蒸馏水至1000ml，pH7.2～7.4,经0.1MPa蒸气灭菌30min备用。摇瓶发酵培养基：豆粕粉(20克)，NaCl(5克),琼脂（15-20克），加蒸馏水至1000ml，pH值自然，经0.1MPa蒸气灭菌30min备用。酵母计数培养基：葡萄糖(5克)，KH2PO45克，大豆多肽溶液或蛋白胨或水3克,加蒸馏水至1000ml，经0.1MPa蒸气灭菌30min备用。其它化学试剂：均为分析纯。主要设备:分光光度计，精密pH计，离心机，氨基酸自动分析仪等。2.2方法及结果分析(1)大豆多肽发酵菌种的分离及驯化取大豆100克，浸泡24h，涝出，加入一定量的食盐和蔗糖，用高压锅蒸煮30min,后接种枯草杆菌，并置于37℃的恒温箱中培养24h后取出观察，选取呈褐色，有拔丝现象，且有比较明显透明圈的大豆作为备选菌种的来源，用接种环接入营养肉汤培养基中，37℃的恒温箱中培养24h后，选取单菌落进行平板划线分离和镜检。若革兰染色呈紫色且有芽孢，则将培养后的平板置于100℃水浴中加热10～15min，然后立即将其接种在营养肉汤培养基中。37℃的恒温箱中培养24h后，再进行平板划线分离和镜检。反复进行几次，即可得到品质较好的用于发酵大豆多肽的菌种。(2)大豆多肽溶液的制备将枯草杆菌的斜面从冰箱中取出，转接活化，37℃的恒温箱中培养24h，然后接种摇瓶发酵培养基,37℃,120r／min摇瓶培养36h,得到的发酵液经5000r／5min,离心30min后的上清液就是大豆多肽溶液(3)蛋白含量和氨基酸含量的测定发酵过程中蛋白浓度、菌体浓度和pH值变化在摇瓶发酵过程中，培养液中蛋白浓度、菌体浓度和pH值随着发酵的进行而发生变化，随着发酵的进行，发酵液中的pH值在发酵起初逐渐升高，36h后达到稳定，基本保持不变；同时，发酵液的OD值也不断增加，菌体迅速生长，36h后减缓，说明菌体生长在36h内就已达到稳定期；而发酵液中的蛋白浓度在发酵开始后的24h内蛋白浓度迅速上升，并达到最高值，此后枯草杆菌分泌的各类蛋白酶继续作用于大豆蛋白，将其进一步水解成短肽和游离氨基酸，蛋白浓度随之逐渐下降。因此，发酵时间确定为36h。氨基酸成分分析大豆蛋白在枯草杆菌分泌的各类蛋白酶的作用下，水解成短肽和游离氨基酸，取此发酵液处理后，对其进行氨基酸组成的分析,大豆多肽中氨基酸含量较高，且具有人体所需的8种必需氨基酸。大豆多肽的组成与大豆蛋白一样，氨基酸比例均衡，是较好的营养物质。(4)酵母生长试验在酵母培养过程中，以大豆多肽或蛋白胨作为酵母生长所需的氮源，通过酵母计数来说明大豆多肽对酵母菌生长的影响，在添加了大豆多肽的培养基中，其酵母细胞数比添加的要高出136％，比仅添加蒸馏水的要高出8.9倍左右，这说明大豆多肽可明显促进酵母细胞的生长。(5)小鼠负重游泳试验将饲喂不同溶液的小鼠放入水池中进行游泳，通过观察小鼠游泳及记录小鼠至淹死所需的时间，来考察大豆多肽对小鼠体能的影响，饲喂大豆多肽组的小鼠坚持游泳的时间最长，而给水组时间最短，表明大豆多肽具有使小鼠提高耐力的作用。同时由于大豆多肽易于吸收，并能迅速被利用，可以及时补充体内蛋白质的消耗，因此，大豆多肽能较好地维持体力，达到抗疲劳的功能。(6)降血脂试验通过对大白鼠血样中血清甘油三脂（TG）、胆固醇（CHO）的含量的分析，大豆多肽可明显降低大鼠血清中甘油三脂的含量，使血清中甘油三脂的浓度较对照组减少了47.3％,同时它对血清中胆固醇也有降低作用，可使血清中胆固醇的浓度较对照组减少35.3％。因此，大豆多肽在降血脂方面有较好的效果。3发酵法生产大豆肽的工艺3．1菌种及原料①菌种：黑曲霉3．35；②原料：豆粕；③液体种子培养基：察氏培养基：NaNO3,0.2g；K2HPO4,0．1g；KC1,0．05g；MgS04,0．05g；FeS04,0．001g；蔗糖,3．0g；蒸馏水100mL；自然pH；④发酵培养基：豆粕，装量为50mL／250mL三角瓶。灭菌后接入液体菌种，振荡培养。3．2发酵法基本工艺：3．2．1工艺流程：3．2．2步骤：(1)菌种活化：液体培养基配制后，灭菌冷却，接入菌种活化，振荡培养12～24h，120r／min，30℃。菌种活化通氧↓↓粉碎配料→灭菌→冷却(接菌)→发酵→分离→真空浓缩→喷雾干燥→筛分→成品（2)粉碎、配料：以豆粕为原料，粉碎细度为100姗的颗粒。经计量后，加入清水与之混合配制混合液．豆粕粉浓度为4％～6％，另91,／Jn入少量辅助配料。搅拌，使混合液均匀。(3)灭菌：配制好的混合液分装，湿热灭菌，温度121℃，压力0．1MPa，时间20min。(4)冷却，接菌：灭菌后的混合液降温至25～28℃．按混合液总量的10％接入菌种并摇匀。(5)发酵：接入菌种后的混合液在发酵罐内进行发酵，发酵温度控制在25～28℃，发酵时间72h，发酵过程中按一定比例向发酵液中通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气，并不断搅拌，使物料液发酵充分和均匀。发酵过程中发酵液的pH值应保持在6．5～7的范围内，出现异常时，用HCL及Ca(OH)进行调节。(6)分离：采用离心方式对发酵液中浆渣进行分离。上清液用于生产大豆肽。(7)真空浓缩：滤液泵入三效低温真空浓缩，干燥掉料液中的部分水分以符合喷雾干燥要求，浓缩后的浓度在40％～50％。低温干燥的目的是不改变蛋白质性质和大豆肽的活性。(8)喷雾干燥：浓缩液经喷雾干燥塔气流喷雾干燥后呈颗粒状，其水分含量8％。(9)筛分：将粉末和大颗粒团分离进行粉碎，经筛分后合格品进行定量包装。(10)成品：产品进行定量包装后经检验可入库储存。在分离纯化方面，大多采用膜法分离。采用超滤膜和纳米滤膜可有效去除生物大分子、无机盐类，得到所需分子量肽链。也有采用高效毛细管电泳及高压液相色谱进行分离，这些方法分离提纯效率高，但价格昂贵。只能适用于分离分析或价值较高产品分离，不适于大规模工业化生产。3．3发酵法生产大豆肽的特点3．3．1改善口感采用微生物发酵法生产大豆蛋白活性肽。通过微生物作用对某些苦味肽基团进行修饰和重组，使小肽之间、小肽与氨基酸之间发生移接、重排。制得的大豆蛋白活性肽无苦味和异味。口感好，克服了酶解法产品苦味大和口感差等缺点。产品可广泛用于食品和医药工业。采用该方法获得的大豆蛋白混合肽含量可达60％以上。3．3．2原料的充分利用一般炼油厂仅仅把榨油后豆粕粉当作动物饲料来处理，这就造成了一定程度上的污染和浪费嘲。以一定浓度的豆粕粉为液体发酵的培养基，经过发酵生产大豆肽，可以一举两得，不仅使豆粕粉这种廉价物得以充分利用，而且可以通过进一步生产加工得到有着良好功能性与营养特性的大豆肽。3．3．3降低大豆肽生产成本在微生物发酵豆粕粉过程中产生丰富的蛋白酶，将豆粕粉中的大豆蛋白分解成多肽。可以特异性地切断疏水性多肽末端的两种疏水性氨基酸，降低了多肽溶液的苦味值。因此，发酵法生产大豆肽将大豆蛋白的水解与大豆肽的脱苦步骤合二为一。很大程度上节省了时间，降低了成本。4前景作为大豆蛋白的一种降解物，大豆肽能有效地改善原料蛋白的各项理化特性f无豆腥味、无蛋白变性、易溶于水、流动性好等)，同时还能赋予产品特殊生理活性的功能。是一种非常有前途的功能性食品原料，是目前国内外研究的热点。近年来。替代医学、天然药物、自然疗法已开始被西方社会认识，美国FDA1999年开始，允许大豆蛋白制品标注可以预防心血管疾病的功能，这就意味着健康与保健品将被人类社会重新认识。而多肽类生化保健品的商业化开发将是这个行业的最精彩篇章。发酵法是国内外生产大豆肽的热点．运用基因技术改善和提高菌种的发酵能力。改善发酵工艺条件，能更充分利用大豆豆粕，减少资源浪费，同时不断改善大豆肽的分离提取技术，提高大豆肽的纯度，还可以运用化学手段对大豆肽进行修饰。使其应用于医药行业，以更加广阔地应用于其它领域。5参考文献[1]王文娟，潘海涛，于磊娟豆粕发酵制备大豆肽的研究[2]邵伟，熊泽，何晓文发酵大豆多肽及其功能研究[3]周伏忠，贾蕴丽，陈国参，谢宝恩，王红云豆粕发酵适宜菌株筛选及其发酵技术研究[4]刘唤明，邓楚津发酵法生产大豆肽的研究