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核酸检验DNA:中性环境带负电荷，变形后OD值升高。用二倍量乙醇沉淀DNA。复制：半保留复制，限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。DNA多聚酶会切除错误的核苷酸。人工合成单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3‘末端的羟基上。大肠杆菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶I,复制最重要的酶是DNA聚合酶III。该酶的核心聚合酶中具有3’-5‘外切酶活性的亚基是ε亚基。聚合酶Iklenow没有5‘-3‘外切酶活性。DNA修复过程中尿嘧啶糖基酶系统不包括SI核酸酶。体内DNA复制时必须有RNA引物。逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶不具备的。转录：DNA解旋部位称启动子。大肠菌RNA聚合酶有5个亚基，σ亚基有启动子作用。翻译：tRNA搬运氨基酸，rRNA是核糖体的骨架，mRNA直接决定蛋白质结构。终止密码：UAA/UAG/UGA。细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始位置。原核生物核糖体由16srRNA/23srRNA/5srRNA组成。真核生物核糖体H1组蛋白最不保守。分子生物学基本技术：质粒a1-200KB不等，双链闭环DNA分子，以超螺旋状态存在于宿主细胞中，具自主复制和转录能力。细菌质粒是重组DNA技术中的常用载体。质粒载体常带有选择性标记基因和多克隆位点。//理想的克隆载体的特性：分子量小、多拷贝、松弛控制性型；具多种限制性内切酶的单切点；能插入较大的外源DNA片段；具容易操作的检测表型。//常用质粒载体1-10kb（PBR322/PUC/PGEM/pBluescript）。//分离质粒DNA的步骤：培养细菌使质粒扩增、收集裂解细胞、分离纯化质粒DNA。//提高质粒收获量：加入抑制蛋白合成的抗生素，细菌停止繁殖后质粒仍在复制。//溶菌酶破坏细胞壁，SDS和Triton-100裂解细胞膜。//离心除去断裂的染色体DNA并细胞的碎片，酚氯仿抽提去掉蛋白，乙醇沉淀质粒DNA，----获得高浓度的质粒溶液。//DNA提取b:异丙醇或乙醇使大分子DNA形成絮团，可减少溶液体积。构建基因组文库DNA长度100kb以上，RFLP和PCR可缩至50KB。多糖和酶类物质对酶切，PCR反应有较强的抑制作用。//RNA提取和cDNA合成c：总RNA制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法。mRNA3‘末端有多聚A，流经oligo纤维素柱纯化。纯化mRNA在70%乙醇-70℃保存一年以上。RNA酶促反应逆转录合成CDNA，将双链CDNA和载体连接，然后扩增转化，获得cDNA文库。可用于真核生物基因结构、表达、调控分析，比较CDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在，了解转录后加工。cDNA合成及克隆步骤：反转录酶合成cDNA第一链，聚合酶合成第二链，加入合成接头、将双链DNA克隆到适当载体（噬菌体或质粒）。//酶切及凝胶电泳d：II类限制性内切酶在分子克隆和微生物鉴定中广泛应用。识别长度为4或6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。DNA电泳图谱：一种结构能形成一种特征性图形，DNA用量0.5-1微克，大多数37℃。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。琼脂糖分离200-50kb的片段，范围广。聚丙烯分离小片段效果好，5-500kb。DNA限制性内切酶酶切图谱称DNA物理图谱，以直线或环状图示表示。//探针和杂交技术：分子杂交--不同来源的互补核苷酸序列形成杂合双链DNA的过程。探针—带有可以识别标记的已知核苷酸序列。Southern杂交：备件对象DNA,northern杂交：备件对象RNA.3种固相支持体：硝酸纤维素滤膜，尼龙膜，Whatman541滤纸。扩增技术：步骤：PCR—变性（94℃）、退火（56℃）、延伸。25-35轮循环，扩增达106倍。主要成分：引物—PCR成败的关键。4种三磷酸脱氧核苷酸—浓度大于50可抑制TapDNA聚合酶活性。Mg2+:浓度对TapDNA聚合酶影响大，浓度0.5-2mmol/L。模板：影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。TapDNA聚合酶：耐高温。反应缓冲液：10-50mmol/Ltris.Cl，20℃下PH8.3-8.8,50mmol/LKCl和适量的Mg2+。高通量检测技术：生物芯片。微型生物化学分析系统。免疫抗原：能与T或B细胞的受体结合，促使其增殖、分化，产生抗体或致敏淋巴细胞，并与之结合，进而发挥免疫效应的物质。特性：免疫原性，抗原性。/既有免疫原性又有抗原性的物质叫完全抗原，只有抗原性的称半抗原。/决定抗原特异性的最小化学亚单位称决定簇（表位）。/依其与胸腺关系分为：胸腺依赖抗原（TD-Ag）、胸腺非依赖抗原（TI-Ag）。绝大多数蛋白质抗原如病原微生物、血细胞、血清蛋白属TD-Ag。/人类血型抗原有A/B抗原，产生A/B抗体。血型抗原是同种异型抗原，是器官移植产生排异反应的原因。/佐剂的机制是增强机体对抗原的免疫应答。抗体：抗原刺激机体由B细胞产生的，本质是免疫球蛋白。结构：4条肽链（2轻L/2H重）由二硫键连接。分别分为可变（V）、恒定（C）部分。CH1和CH2之间为铰链区。（木瓜酶水解IgG为2Fab和Fc；胃蛋白酶水解IgG为F（ab‘）2和Fc）。/抗原的分类依据H链的结构特点，主要依Fc部分（CH），分5类ADEMG。F（ab‘）2与抗原结合部，VH+VL是F（ab‘）2的高变区。/IgM分子量最大，免疫应答早期产生的抗原主要是IgM；IgG血清中含量最高，唯一能通过胎盘；IgA经J链连接可形成多聚IgA；与分泌片结合后能抵抗蛋白酶水解作用；IgE与肥大细胞膜上的Fc受体结合。抗原抗体反应：非共价结合，静电引力。补体：不耐热（灭活温度56℃），可辅助特异性抗体介导的溶菌作用。9种成分，11种蛋白。补体激活途径：传统途径---可被Ag-Ab免疫复合物（IC）活化，顺序（142356789）；旁路途经---被细菌的脂多糖激活。免疫系统：中枢免疫器官—骨髓、胸腺、法氏囊。/周围免疫器官-脾脏、淋巴结、皮肤、黏膜。/免疫细胞：干细胞、淋巴细胞系、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、NK细胞。/免疫分子：TCR,BCR,CD,MHC,Ig，补体,细胞因子。各免疫细胞特点：T细胞：Ts细胞抑制细胞，CD8+参加免疫调节，Tc是细胞毒细胞，Th是辅助性T细胞，成熟需要胸腺加工处理。T细胞定位于淋巴结副皮质区。B细胞：主管体液免疫调节。成熟在骨髓中。活化B细胞可衍变成浆细胞。人类外周血T:B细胞为2:1.单核类细胞：抗体检测：抗体检测的方法主要决定灵敏度，抗原种类决定了特异性。1.中和反应—测定抗体是否存在，测定抗体是否具免疫保护作用，只能反应抗体阻断病毒进入细胞的能力。2.沉淀反应—血清蛋白，细胞裂解液，组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合出现沉淀物。可检测20-2mg/ml水平的抗体。（单向免疫扩散检测IgG/M/A和补体C3的含量；双项免疫扩散定性定量检测）3.凝集反应—细菌红细胞等颗粒性抗原与抗体结合后形成凝集团。检测到1微克/ml水平。（直接凝集----玻片凝集，定性测抗原，快速诊断；试管凝集：定量测抗体。间接凝集：）。4.补体参加的反应。补体结合和溶血空斑试验。5.标记抗原进行的抗原抗体反应。（免疫荧光--酶免疫测定、ng/ml或pg/ml。标记的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。方法有酶联免疫吸附试验，双抗体夹心法，间接法。--放射免疫测定，125I和131I---免疫印迹法）。抗体检测用到的抗原（1，全菌或全病毒抗原—细菌凝集试验或免疫荧光检测；2.替代抗原—检测立克次氏体使用的变形杆菌抗原或诊断梅毒的牛心脂抗原；3.粗提取抗原；4.粗提纯抗原—层析纯的纯度。抗体本底：在无疾病的人或动物中现实一定程度的反应。来源（杂散抗原、共同抗原—可在无疾病个体中产生高滴度抗体、既往感染）。细胞免疫检验：检测淋巴细胞--先制备外周血单个核细胞，方法为葡聚糖-泛影葡胺（淋巴细胞分离液）密度梯度离心。类型鉴定方法（免疫荧光、磁珠分离、淘选法、流式细胞术）。功能测定---T细胞：增殖试验，3H-TdR渗入法/细胞毒试验，51Cr释放法、乳酸脱氢酶释放法、皮肤试验。B细胞：增殖试验、抗体形成细胞测定（溶血空斑试验）。免疫细胞因子测定—免疫学检测法，RT-PCR法。单克隆抗体：一种B淋巴细胞抗原刺激后只能产生一种抗体。卫生毒理学毒物：较小剂量进入机体能干扰正常的生化过程或生理功能，引起暂时性或永久性病理改变，甚至危及生命的化学物质。绝对致死量LD100:全部死亡的最低剂量。最小致死剂量LD01：个别死亡的最低剂量。最大耐受剂量LD0：不死亡的最高剂量。半数致死量LD50：一半死亡。最小观察到有害作用剂量：少数个体出现最轻微异常改变所需的最低剂量。外源化合物在体内的生物转运：吸收、分布、代谢、排泄。毒性作用：急性---初成年动物。亚慢性---慢性---亚慢性和慢性选用初断乳小鼠15g，大鼠100g。观察指标：一般性指标（动物体重、食物利用率、中毒症状、器官系数、血液指标、生化指标）病理学检查、特异指标。突变：基因突变（碱基置换、移码突变、大段损伤）、染色体畸变（断裂、缺失、重复、倒位、易位）、染色体分离异常。致癌作用：遗传性致癌物以DNA为作用靶点的化学物质，非遗传性的是DNA外的靶点，涉及细胞间隙通信连接、信号传导系统、激素作用。化学致癌过程：细胞增殖、细胞程序性死亡、DNA损伤与修复。危害特征描述既剂量反应关系评价----核心内容。