微生物检验第四章细菌耐药检验.

第十一章细菌耐药性检测1.葡萄球菌属的天然耐药•对第一代喹诺酮类天然耐药。•腐生葡萄球菌对磷霉素天然耐药。•耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌对所有β-内酰胺类抗菌药物耐药。包括青霉素类、头孢菌素类、含酶抑制剂的复合制剂、碳青霉烯类、氨曲南、头霉素类。2.肠球菌的天然耐药•对一、二、三、四头孢菌素、克林霉素、磺胺类、氨基糖苷类（高浓度除外）天然耐药。•可选范围：青霉素、氨苄西林、万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺、头孢硫脒等。3.链球菌天然耐药•肺炎链球菌对第一代喹诺酮类药物耐药，并对诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星敏感性低。链球菌对氨基糖苷类天然耐药或对水平耐药。4.李斯特菌天然耐药•对磺胺类、杆菌肽、多粘菌素、头孢菌素类天然耐药。细菌的常见耐药机制•细菌耐药机制主要有四种：1.产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶；2.抗生素作用的靶位改变，包括青霉素结合蛋白位点、DNA解旋酶、DNA拓扑异构酶Ⅳ的改变等；3.细菌膜的通透性下降，包括细菌生物被膜的形成和通道蛋白丢失；4.细菌主动外排系统的过度表达。•在上述耐药机制中，第一、二种耐药机制具有专一性，第三、四种耐药机制不具有专一性。β-内酰胺酶•β内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外，革兰阴性杆菌间质中；•检测方法有微生物培养法、碘－淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速，应用于临床检测。超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）•ESBLs是指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类和单环内酰胺类氨曲南的一类酶；•ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物，能被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等内酰胺酶抑制剂所抑制；•ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷菌属等其他肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌。超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）•稀释法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL：•头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松或氨曲南MIC≥2mg/mL•或头孢泊肟MIC≥8mg/mL超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）•纸片法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL（筛选阳性）：•头孢泊肟≤17mm•头孢他啶≤22mm•头孢噻肟≤27mm•头孢曲松≤25mm•氨曲南≤27mm超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）•纸片法（表型确认试验）•头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。•任一复方制剂的抑菌圈直径与相应单药抑菌圈直径相差≥5mm时，即可判断该菌产ESBL。超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）•稀释法（表型确认试验）•头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。•任何一组酶抑制剂复方制剂的MIC值比相应单药的MIC降低3个稀释度者即可判定该菌为产ESBL菌株。AmpC酶的特征•AmpC酶是在革兰阴性菌中发现的由染色体或质粒介导的水解头孢菌素的Ⅰ型β内酰胺酶，可分为诱导酶和非诱导酶。•与ESBLs不同的是，AmpC酶对三代头孢菌素耐药但对四代头孢菌素敏感且不被酶抑制剂克拉维酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。AmpC酶的检测方法•头孢西丁三维试验是检测AmpC酶的经典方法；•除此之外，还有以硼酸化合物为抑制剂检测肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的AmpC酶、AmpCDisk、头孢西丁琼脂基础法等。碳青霉烯酶•碳青霉烯酶可以定义为具有水解碳青霉烯类抗生素活性的β-内酰胺酶，主要分布于β-内酰胺酶A、B、D类中。•根据水解机制中作用位点的不同可以将碳青霉烯酶分为两大类：–一类称为金属碳青霉烯酶，这类酶以金属锌离子为活性作用位点，可以被EDTA抑制，属于B类β-内酰胺酶；–另一类以丝氨酸（Ser）为酶的活性作用位点，可以被酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制，属于A、D类β-内酰胺酶。•耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）携带SCCmec基因盒。SCCmec基因盒中的MecA基因编码修饰的青霉素结合蛋白PBP2a，这种蛋白对甲氧西林和其他的β-内酰胺类抗生素亲和力下降，从而导致对这些抗生素的耐药。•SCCmec主要由mec复合物和ccr复合物两部分组成。根据不同mec复合物和ccr复合物的组合，可以将SCCmec分成不同的型别，目前已发现8种SCCmec型。耐甲氧西林葡萄球菌耐甲氧西林葡萄球菌的检测•MRSA的检测方法有头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法、乳胶凝胶试验检测PBP2a、mecA基因测定及MRSA显色培养基。•头孢西丁纸片法、苯唑西林琼脂稀释法是目前检测耐甲氧西林葡萄球菌最常用筛选方法。•对于金黄色葡萄球菌，MRSA的检测可以使用苯唑西林纸片，但对于凝固酶阴性葡萄球菌则不能使用苯唑西林纸片。甲氧西林耐药的葡萄球菌（MRS）MRS检测药物纸片法稀释法金黄色葡萄球菌1mg苯唑西林√√路邓葡萄球菌1mg苯唑西林×√金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌30mg头孢西丁√√除路邓以外的凝固酶阴性葡萄球菌1mg苯唑西林×√30mg头孢西丁√×凝固酶阴性葡萄球菌中苯唑西林MIC结果的报告策略*苯唑西林MIC(µg/ml)进行mecA或PBP2a或头孢西丁纸片扩散≤0.25≥4.00.5-2.0报告苯唑西林敏感报告苯唑西林耐药阴性阳性报告苯唑西林敏感报告苯唑西林耐药*检测无菌部位感染的非表皮葡萄球菌菌株克林霉素诱导耐药葡萄球菌•红霉素*耐药的金葡菌或凝固酶阴性葡萄球菌可对克林霉素结构性或诱导性耐药或仅对红霉素耐药。*或其他大环内酯类机制耐药基因红霉素克林霉素核糖体修饰-药物不能结合于靶位ermRS*RR结构性泵-药物被泵出msrARSerm=erythromycinribosomemethylasemsrA=macrolidestreptograminresistance*需要诱导来显示耐药性红霉素/克林霉素耐药葡萄球菌耐药机制诱导性克林霉素耐药（erm介导）葡萄球菌-“D试验”患者不会对克林霉素有反应-报告克林霉素耐药无克林霉素诱导（msrA介导）真的克林霉素敏感-报告克林霉素敏感“D”阳性阴性15～26mm葡萄球菌诱导性克林霉素耐药的MIC检测方法4.0µg/ml红霉素0.5µg/ml克林霉素Nogrowth=无诱导性克林霉素耐药生长=诱导性克林霉素耐药对于红霉素耐药，克林霉素敏感的葡萄球菌，需检测诱导性克林霉素耐药•注意–试验适用于金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌(苯唑西林敏感和耐药株)；–对于CoNS，该试验不必常规开展因为克林霉素很少用于治疗凝固酶阴性葡萄球菌；–大多数医院相关MRSA是克林霉素耐药的；–大多数社区相关MRSA是克林霉素敏感的(msrA基因型)；–克林霉素可以口服给药。万古霉素中介耐药的金黄色葡萄球菌（VISA）耐药是由于：增厚的细胞壁检测困难；表型不稳定菌落形态不典型金葡菌万古霉素敏感万古霉素中介细胞壁当有以下一个或多个情况时菌株可疑为VISA•-內酰胺类药物的MIC降低•达托霉素MIC升高•菌落形态不典型（一些为微小菌落）•肉汤中生长迟缓（如血培养）•凝固酶反应微弱/延迟•经过几次次代培养后：–菌落回复为典型形态–万古霉素MIC降低并且菌株变为万古霉素敏感万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌（VRSA）耐药是由于从万古霉素耐药肠球菌（VRE）中获得vanA基因美国报道例数9个患者检测大多数标准方法均可检测菌落形态典型金葡菌纸片扩散法折点葡萄球菌-万古霉素CLSI文件Susceptible敏感Intermediate中介Resistant耐药M100-S18200815--New!新M100-S192009*---CLSIM100-S19.Table2C.对于金黄色葡萄球菌*假如抑菌圈≥7mm，用MIC法检测万古霉素（若有需要）•万古霉素纸片扩散法仅在检测携带van-A金葡菌（VRSA）时可信；需确证没有抑菌圈(≤6mm)•纸片扩散法不能鉴别VSSA和VISA•纸片扩散法不能检测凝固酶阴性葡萄球菌肠球菌高水平氨基糖苷类耐药筛查•纸片扩散法–120µg庆大霉素;300µg链霉素–10mm=无高水平氨基糖苷类耐药•MIC筛查–庆大霉素:500µg/ml–链霉素:1000µg/ml(肉汤)2000µg/ml(琼脂)肠球菌氨基糖苷类修饰酶链霉素庆大霉素妥布霉素阿米卡星/丁胺卡那6-AAD+---3’APH---+2”APH/6’AAC-+++6’AAC*--++*在所有屎肠球菌中均发现+=酶可以修饰药物；药物无协同性-=酶不能修饰药物；药物有协同性万古霉素耐药肠球菌（VRE）表型•VRE－屎肠球菌中居多–vanA-高水平耐药(MIC256µg/ml)–vanB-中等水平耐药(MIC16-256µg/ml)•低水平万古霉素耐药–vanC-(MIC2-16µg/ml)–vanC天然存在于鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌–菌株不引起院内爆发，vanC基因不易于传播–纸片扩散法实验可能检测不出快速MGP实验，孵育3-5小时；甲基化-a-D-葡糖苷酸化＝黄色阳性阴性铅黄肠球菌的黄色色素VRE肺炎链球菌新的青霉素折点(µg/ml)敏感中介耐药青霉素注射(非脑膜炎)≤248青霉素注射(脑膜炎)≤0.06-0.12青霉素(口服青霉素V)≤0.060.12-12CLSIM100-S19.Table2G.纸片药物含量抑菌圈(mm)MIC(µg/ml)等效的MICRISRS青霉素1µg苯唑西林--20-≤0.06CLSIM100-S19.Table2G.肺炎链球菌纸片扩散法-使用苯唑西林纸片作为青霉素敏感性的替代纸片•20mm-报告“敏感”：–青霉素–头孢噻肟/头孢曲松–其他ß-内酰胺类•19mm-进行MIC实验：–青霉素•苯唑西林纸片敏感或20mm对应脑膜炎或口服青霉素的敏感折点(MIC≤0.06µg/ml)CLSIM100-S19.Table2G.肺炎链球菌纸片扩散法-使用苯唑西林纸片作为青霉素敏感性的替代纸片肺炎链球菌青霉素EtestMIC结果判读青霉素MIC的Etest测定肺炎链球菌MIC=3mg/ml