微生物测定标准操作规程CP

起草人Preparedby:起草日期Date:_____________________QC审核人Reviewedby:审核日期Date:_____________________QC审核人Reviewedby:审核日期Date:QA批准人Approvedby:批准日期Date:质量部QD颁发部门IssuedbyQC执行日期EffectiveDate替换文件ReplacedForSOP-QC-540-06微生物限度测定标准操作规程复审日期ReviewDate分发部门：DistributedtoQA,QC分发号DistributionNo.:目的Purpose依据中国药典2015版，建立物料微生物限度的标准测定程序，以保证有关物料项下的微生物限度的测定符合药典及现行GMP的要求。TSIGROUP—YessaminHealth标准操作规程StandardOperatingProcedure页码/Page:2of13微生物限度测定标准操作规程(CP)TestingProcedureforMicrobialLimit(CP)编号/No.:SOP-QC-M013版本号/Version:00范围Scope适用于QC按照中国药典相关规定所进行的微生物限度的测定。职责ResponsibilityQC检验员负责遵守该规程，QC负责人负责监督与管理。内容Procedure1微生物计数法1.1概述1.1.1微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。1.1.2微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中的微生物的检出。1.1.3如供试品中有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。1.1.4供试液制备是如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。1.1.5微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行。1.1.6除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为20～25℃。1.2计数方法1.2.1计数方法包括平皿法、薄膜过滤法、和最可能数法（MPN法）。MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。1.2.2供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。1.3检验量1.3.1检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。1.3.2除另有规定，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重物料、微量包装的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。1.4供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需要加温时，应均匀加热，且温度应不超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。TSIGROUP—YessaminHealth标准操作规程StandardOperatingProcedure页码/Page:3of13微生物限度测定标准操作规程(CP)TestingProcedureforMicrobialLimit(CP)编号/No.:SOP-QC-M013版本号/Version:00常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。1.4.1水溶性供试品取供试品10g/ml，用大豆酪蛋白消化肉汤或磷酸盐缓冲液（pH7.2）至100ml，混匀，作为1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8,。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系类稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。1.4.2水不溶性非油脂类供试品取供试品10g/ml，用大豆酪蛋白消化肉汤或磷酸盐缓冲液（pH7.2）至100ml，混匀，作为1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系类稀释。1.4.3油脂类供试品取供试品10g/ml，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过40℃（特殊情况下，最多不超过45℃），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释液使成1:10供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步10倍系列稀释。1.5需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定大豆酪蛋白消化琼脂或大豆酪蛋白消化肉汤用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂用于测定霉菌和酵母菌总数。阴性对照试验：以稀释液代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。1.5.1平皿法平皿法包括倾注法和涂布法。倾注法：除另有规定外，取规定量供试品，按1.4进行供试液制备，取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃熔化的大豆酪蛋白消化琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。涂布法：取15～20ml温度不超过45℃的大豆酪蛋白消化琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注入直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表面干燥。若使用直径较大的平皿，培养基用量也应相应增加。每一平板表面接种按1.4制备的供试液不少于0.1ml。除另有规定外，大豆酪蛋白消化琼脂培养基平板在30～35℃培养3～5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5～7天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报TSIGROUP—YessaminHealth标准操作规程StandardOperatingProcedure页码/Page:4of13微生物限度测定标准操作规程(CP)TestingProcedureforMicrobialLimit(CP)编号/No.:SOP-QC-M013版本号/Version:00告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按SOP-QC-M009《微生物菌落计数报告规则集结果判断》报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。1.5.2薄膜过滤法薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于0.45μm，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物的截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液剂冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml。总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。除另有规定外，取规定量供试品，按1.4进行供试液制备，取供试液适量（一般取相当于1g、1ml或10cm2的供试品，哦供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液中，混匀，过滤。用适量的冲洗液冲洗滤膜。若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于大豆酪蛋白消化琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。大豆酪蛋白消化琼脂培养基平板在30～35℃培养3～5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5～7天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。菌落数报告规则以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以1报告菌落数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或以1乘以稀释倍数报告菌数。1.5.3MPN法MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，本法不适用于霉菌计数。若使用MPN法，按下列步骤进行。取1.4制备的供试液至少3个连续稀释度，每一稀释级取3份1ml分别接种至3管装有9～10ml大豆酪蛋白消化肉汤培养基中，必要时可在培养基中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂。接种管置30～35℃培养3天，逐日观察各管微生物生长情况。如果由于供试品的原因使得结果难以判断，可将该管培养物转种至大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂培养基中，在相同条件下培养1～2天，观察是否有微生物生长。从下表中查每1g或1ml供试品中需氧菌总数的最可能数。微生物最可能数检索表TSIGROUP—YessaminHealth标准操作规程StandardOperatingProcedure页码/Page:5of13微生物限度测定标准操作规程(CP)TestingProcedureforMicrobialLimit(CP)编号/No.:SOP-QC-M013版本号/Version:002控制菌检查法2.1概述控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。供试液制备及试验环境要求同微生物计数法。如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。TSIGROUP—YessaminHealth标准操作规程StandardOperatingProcedure页码/Page:6of13微生物限度测定标准操作规程(CP)TestingProcedureforMicrobialLimit(CP)编号/No.:SOP-QC-M013版本号/Version:00供试液制备是如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。2.2供试品检查供试品的控制菌检查应按经方法适用性试验确认的方法进行。2.2.1阳性对照试验阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查，对照菌的加量应不大于100cfu。阳性对照试验应检出相应的控制菌。2.2.2阴性对照试验以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。2.2.3胆汁耐受革兰氏阴性菌（耐胆盐革兰阴性菌）•供试液制备和预培养取供试品，用大豆酪蛋白消化肉汤作为稀释剂照“微生物计数法”制成1:10供试液，混匀，在20～25℃培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增值（约2小时）。•定性试验除另有规定外，取相当于1g或1ml供试品的上述预培养物接种至10ml肠道增菌肉汤培养基中，30～35℃培养24～48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～24小时.如果平板上无菌落生长，判供试品未检出胆汁耐受革兰氏阴性菌。•定量实验选择和分离培养：取相当于0.1g、0.01g和0.001g(或0.1ml、0.01ml或0.001ml)供试品的预培养物或其稀释液分别接种至9ml肠道增菌肉汤培养基中，30～35℃培养24～48小时。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30～35℃培养18～24小时。•结果判断若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，从下表查1g或1ml供试品中含有胆汁耐受革兰氏阴性菌的可能数。胆汁耐受革兰氏阴性菌的可能数（N）各供试品量的检查结果每1g(或1ml)供试品中TSIGROUP—YessaminHealth标准操作规程StandardOperatingProcedure页码/Page:7of13微生物限度测定标准操作规程(CP)TestingProcedureforMicrobialLimit(CP)编号/No.