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1课题1微生物的实验室培养基础知识一、培养基1．概念：人们按照微生物对__营养物质_的不同需求，配制出的供其___生长繁殖___的营养基质。2.种类：按照培养基的物理性质划分（1）___液体____培养基：配制成的____液体___状态的基质。（2）__固体______培养基：在_____液体___培养基中加入___凝固剂__，如琼脂后，配制成的____固体___状态的基质，是实验室中最常用的培养基之一，微生物在其上面生长，可形成肉眼可见的_____菌落____。3.组成成分：各种培养基的具体配方_不同____，但一般都有_____水______、_____碳源______、_____氮源______、____无机盐_______，此外培养基还需要满足微生物生长对___PH________、____特殊营养物质_______以及____氧气_______的需求。二、无菌技术获得纯净培养物的关键是_____防止外来杂菌的入侵________。1．消毒是指使用____较为温和_____的物理方法或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分____对人体有害______的微生物（不包括__芽孢__和__孢子____）。实验室常用的消毒方法有____煮沸消毒法______、____巴氏消毒法_____、____化学药剂消毒法____。2.灭菌是指使用____强烈_____的理化因素杀死___物体内外所有_____的微生物，包括_____芽孢_____和_____孢子_____。常用的灭菌方法有____灼烧灭菌___、__干热灭菌__、___高压蒸汽灭菌____。3.实验操作中避免杂菌的污染，主要包括四方面的内容：（1）对实验操作的__空间____、操作者的___衣着和手_____进行清洁和消毒。（2）将用于微生物培养的__器皿__、___接种用具____和___培养基____等进行灭菌。（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在____酒精灯火焰____附近进行。（4）实验操作时应避免______已经灭菌处理____的材料用具与周围物品相接触。4.在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被_____微生物污染____。使用后的培养基丢弃前一定要进行____灭菌____处理，以免污染环境。三、分离纯化大肠杆菌本实验使用的培养基为_____牛肉膏蛋白胨_____培养基。进行大肠杆菌的纯化培养，可分为___制备培养基_____和______纯化大肠杆菌_________两个阶段。1.制备培养基的一般步骤为：_____计算_____、____称量___、_____溶化_____、____灭菌______、_____倒平板______。2.纯化大肠杆菌：微生物接种最常用的方法是____平板划线法_____和____稀释涂布法____。（1）平板划线法通过_____接种环______在琼脂固体培养基表面连续___划线____的操作，将_____聚集_____的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。（2）稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的_____梯度稀释______，然后将不同稀释度的菌液_____分布涂布______到琼脂固体培养基的表面，进行培养。3.菌落的概念：_____由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体________。4.结果分析：（1）如果接种了大肠杆菌的培养基上生长的菌落颜色、形状、大小基本一致，说明_______接种符合要求_______；（2）若培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中_______有杂菌未消化___________；（3）未接种大肠杆菌的空白对照的培养基在培养过程中若长出菌落，则说明____培养基灭菌______不彻底，实验失败。四、菌种保存1.对于频繁使用的菌种，可以采用_______临时保藏________的方法。（1）过程：首先将菌种接种到试管的_______固体斜面培养基上_____，合适温度下培养，菌落长成后，放于____4℃__冰箱中保藏，每隔3—6个月，都要将菌种从旧的培养基上转移到新的培养基上。（2）缺点：保存时间_____短________，菌种容易被___污染________或产生_____变异____。2.对于需要长期保存的菌种，可以采用______甘油管藏_______的方法，将培养的菌液与等体积灭菌后的甘油混匀于____-20℃____的冷藏箱内保存。随堂练习1．用平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时(C)①可以用相同的培养基②都需要使用接种针进行接种③都需要在火焰旁进行接种④都可以用来计数活菌A．①②B．③④C．①③D．②④2．下列有关微生物培养与应用的说法正确的是(C)A．天然培养基是指直接取自自然界不需加工的培养基B．接种前需对培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手等进行严格的灭菌处理C．大肠杆菌的纯化培养过程包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段D．分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源和碳源3．下列对灭菌和消毒的理解不正确的是(B)A．灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子B．消毒和灭菌实质上是完全相同的C．接种环用灼烧法灭菌D．常用灭菌方法有灼烧灭菌法、干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法4．用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是(C)A．未接种的选择培养基B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D．接种了的选择培养基5．下列关于微生物的分离和培养的有关叙述，错误的是(A)A．微生物培养前，需对培养基进行消毒B．分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度C．测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源6．三个培养皿中分别加入10mL不同的培养基，然后接种相同的大肠杆菌样液。培养36h后，计算菌落数，结果如下表。下列选项正确的是(D)2培养皿培养基成分菌落数Ⅰ琼脂、葡萄糖35Ⅱ琼脂、葡萄糖、生长因子250Ⅲ琼脂、生长因子0A.该实验采用的是液体培养基B．该实验采用平板划线法接种C．Ⅰ和Ⅲ对照，说明大肠杆菌的生长不需要生长因子D．Ⅱ和Ⅲ对照，说明大肠杆菌的生长需要葡萄糖7.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是(C)A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板8.有关倒平板的操作错误的是…………(C)A．将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上B．使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰C．将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌子上D．等待平板冷却凝固后需要倒过来放置9.有关平板划线操作正确的是…………(D)A．使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌B．打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞c．将沾有菌种的接种环迅速伸人平板内，划三至五条平行线即可D．最后将平板倒置，放人培养箱中培养10.关微生物营养物质的叙述中，正确的是(D)A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量8．下表是用于从土壤中分离纯化土壤细菌的培养基配方。请回答：试剂牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水用量5g10g5g20g1000mL(1)培养基的类型有很多，但培养基中一般都含有水、碳源、__氮源__和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源的成分是_牛肉膏和蛋白胨__。培养基配制完成以后，一般还要调节pH，并对培养基进行__灭菌_处理。该培养基从物理性质上分类属于_固体培养基_。(2)分离纯化微生物最常使用的接种方法是__平板划线法_和__稀释涂布平板法_。(3)假设培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？(列举两项)___稀释倍数不够，菌液的浓度太高；划线时，划完第一次没有灭菌即接着划第二次；培养过程中灭菌不严格，受到了其他微生物的污染。____。9.葡萄酒是具有多种营养成分的高级饮料。某同学制作葡萄酒的过程大致如下：将冲洗过并晾干的成熟葡萄捏烂，与糖按10∶3的比例放入发酵瓶，搅拌密封后发酵。初期，泡沫不断增多，随着时间的延长，泡沫逐渐减少，待基本不产生气泡后，结束发酵。根据上述过程，回答以下问题。(1)发酵所需的酵母菌菌种的来源是__葡萄表皮上附着的野生型酵母菌______。(2)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种。若想筛选出这样的菌种，步骤如下：①获得野生菌：从酵母菌的生存环境中获得野生菌；②制备__选择_培养基：在基本培养基的基础上，注意添加_适量的糖(蔗糖或葡萄糖)___并__调整pH__，灭菌后制成平板；③接种：采用_稀释涂布平板(或平板划线)_法将野生菌接种在平板上；④培养：在适宜条件下培养一定时间；⑤选种：从__生长良好的菌落_中筛选出所需要的菌株。(3)增大接种量能缩短发酵时间。为增加菌种的量，在上述⑤中获得所需菌株后，可以采取的措施是_扩大培养(或多次培养)_。(4)酿酒过程中，经检测发现活菌数量适宜却不产生酒精。在酿酒初期应采取的措施是__隔绝空气(或加强密封)_。(5)葡萄汁中加入糖的目的是_酵母菌提供碳源，促进发酵_。(6)密封发酵后泡沫增多，这时应该采取的措施是_松盖放气__。(7)为研究发酵瓶中酵母菌的生长状况，常进行取样统计分析。一般用显微计数法测定酵母菌数量时常常需要借助一种特制的载玻片——__血球计数板_来完成。13．(2009·上海卷)氯苯化合物是重要的有机化工原料，因其不易降解，会污染环境。某研究小组依照下图所示的实验方案，筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培养基配方如表。表培养基的组成液体培养基蛋白胨牛肉膏氯苯氯化钠硝酸铵无机盐(无碳)蒸馏水Ⅰ号10g5g5mg5g－－1LⅡ号－－50mg5g3g适量1LⅢ号－－20--80mg5g3g适量1L(1)配制Ⅱ号固体培养基时，除添加Ⅱ号液体培养基成分外，还应添加1%的__琼脂____。(2)培养基配制时，灭菌与调pH的先后顺序是__先调pH，后灭菌_。(3)从用途上来说，Ⅰ号培养基和Ⅱ号培养基分别属于____基本(通用)___培养基和____选择_培养基。在Ⅱ号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是____硝酸铵__。(4)在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为_芽孢_。