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第五章微生物生长及纯培养微生物生长及纯培养•微生物生长的测定•微生物群体的生长规律•微生物的分离和培养微生物个体重量的增加和体积增大的现象生长：微生物数量增多的现象繁殖：一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长一、微生物生长的测定•微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体的生长很难测定，而且也没有什么实际应用价值。因此，在微生物学的研究和应用中，通常是测定群体的增加量，即群体的生长。•测定不同种类、不同生长状态微生物的生长情况，需要选用不同的指标。通常对单细胞微生物来说，既可测定细胞数目，又可测定细胞的质量；而对多细胞微生物(尤其是丝状真菌)，则常以菌丝生长的长度和质量等作为生长指标。•直接计数法•间接计数法（一）直接计数法1、显微计数法采用血球计数板置于显微镜下进行计数，将一定稀释度的细胞悬液加到计数室中，在显微镜下进行计算细胞个数，每个小室内4—5个细胞为宜该方法操作简便、快速，适用于单细胞的微生物测定，通过染色，可以鉴别活菌和死菌血球计数法****#####2、比浊法原理：当光线通过微生物菌悬液时，菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。利用浊度计或比色计测定,得到OD值，与细胞数量成正比，还可进行平板计数，对比一定浑浊度所含活菌数作曲线。适用于菌体分散良好的非菌丝体的单细胞微生物的测定。该方法简便、快捷、可以连续测定，适用于发酵生产过程的监测菌体生长情况，被广泛利用。3、平板菌落计数法•是一种常用的活菌计数法。•将被测菌体稀释到一定浓度，取一定量的稀释液接种到平板上，培养后可形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落则代表一个细胞，计算菌落数。根据稀释倍数与吸样量可推算出细胞数目。•一般用9cm的培养皿，每个稀释度作3个平皿培养，取平均值，通常每个平板长30～300个菌落为宜。•平板计数法可分为两种：涂布法和倾注法。•该方法多用于教学、科研、食品检验，在测定水、土壤、食品、化妆品及其他材料的活菌测定。1594、干重测定法•可用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10～20%，将待测培养液离心或过滤后，用清水离心洗涤1～5次，进行干燥，然后称干重。干燥温度可采用100～105℃烘干或置于真空干燥箱中60～80℃，也可在红外线烘干，恒重后称重。•注：培养物中除菌体外无其它固体颗粒。•若是固体培养物，则可先将其溶化再过滤或离心出菌体。•对单、多细胞均适用，是测定菌丝体的常用方法。主要对丝状真菌生长长度的测定，一般在固体培养基上进行，有两种方法。将真菌接种在平皿的中央，定时测定菌落的直径或面积，直到菌落覆盖整个平皿为止，绘制生长曲线。缺点：不能反映菌丝的纵向生长。5、菌丝长度测定法6、液体稀释法是一种常用的活菌计数法。对被测样品做连续的10倍系列稀释。根据估计数，从最适宜的3个连续的10倍稀释液中各取5ml试样，接种到3组共15支装有培养液的度管中（每管接1ml）。经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大概率表（MPN），再根据稀释倍数计算出活菌含量。1、测定细胞组分的含量进行估算每种微生物细胞中核酸及蛋白质的含量较为恒定，另外ATP的含量也较为稳定，所以一般采取以下方法进行间接测定。•测定DNA的含量•测定蛋白质的含量•测定ATP的含量（二）间接测定法2、从培养基中某营养物的消耗量来估算营养物质不能是合成代谢的产物，如磷酸盐。3、从菌体代谢产物来估算4、从发酵液的黏度来估算5、从发酵的放热量来估算6、从发酵液的酸碱度来估算在发酵过程中，微生物的生长及代谢产物的产生，会使体系的PH值发生一定的变化。微生物的特点：个体微小肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个单个的微生物组成的群体。微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础二、微生物群体的生长规律二、单细胞微生物的生长曲线多数细菌的繁殖速度很快。大肠杆菌在适宜的条件下繁殖48h，其子代总重可达2.2×1031g，这是一个巨大的数字。然而，实际情况是不可能的。那么，细菌的群体生长规律到底怎样呢?将少量单细胞细菌纯培养物接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定细胞含量，可以看到以下现象：开始有一短暂时间，细胞数量并不增加，随之细胞数目增加很快，继而细胞数又趋稳定，最后逐渐下降。如果以培养时间为横坐标，以细菌细胞数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到一条曲线，称为生长曲线。微生物典型生长曲线总菌数活菌数培养时间/hⅡ.对数期Ⅲ.稳定期Ⅳ.衰亡期Ⅰ.延迟期细菌数目（个/ml）对数ⅡⅢⅣⅠ根据该生长曲线的变化规律，可将生长曲线大致分为四个时期：（一）延迟期•延迟期出现的原因把少数单细胞微生物接种到新鲜的培养基中培养时，细胞并不立即进行分裂繁殖，微生物的增殖数为０，这时细胞需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物，因此要经历一个调整和适应过程。延迟期的特点1、生长速率常数为零；2、细胞形态变大或增长；3、细胞内的RNA含量增高4、合成代谢十分活跃；5、对外界不良环境反应敏感。影响延迟期长短的因素1.菌种特性；2.接种龄；3.接种量；4.培养基成分（二）对数生长期•对数期的特点1、活菌数和总菌数接近2、生长速率常数最大，代时（G）最短3、细胞进行平衡生长，细胞的化学组成及形态，生理特性比较一致4、酶系活跃，代谢旺盛•该期的微生物生产中多被用做种子和科学试验材料N2N1t2t1细胞数/mlnt2-t1代时:G=由于二分裂，经过n次分裂后，t2时刻的菌N2=N1×2n,即:lgN2=lgN1+nlg2lg2lgN2-lgN1繁殖代数:n=t2-t1n生长速率常数:R=•生长速率常数R：单位时间内的繁殖的代数。•代时G:细胞每分裂一次所需的时间。•R=1/G影响对数期微生物代时长短的因素•菌种•营养成分•营养物浓度•培养温度（三）稳定期•稳定期的特点1、生长速率常数R等于零，活菌数达到最高峰，并保持相对稳定。2、微生物细胞内代谢物积累达到最高峰。3、芽孢杆菌这时开始形成芽孢。4、这是产物（菌体或与菌体生长相平行的代谢产物）的最佳收获时期。••稳定期到来的原因1、营养物尤其是生长限制因子的耗尽2、营养物的比例失调3、有害代谢产物的积累4、pH值等理化条件不适宜生长限制因子:凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物。x—为稳定时期细胞干重（g/ml培养液）x0—为刚接种时的细胞干重（g/ml培养液）c0—为限制性营养物的最初浓度（g/ml）c—为稳定时期限制性营养物的浓度例：实验计算产黄青霉的值为1：2.56表示每2.56克葡萄糖可合成1克菌丝体（干重）•在稳定期，菌体产量与营养物质的消耗之间具一定比例关系，这一关系就是生长产量常数Y（或生长得率）Y=x-x0c0-c=x-x0c0（四）衰亡期衰亡期的特点1、微生物死亡数大于增殖数，活菌数大大减少，群体衰落2、细胞出现多形态,大小不等畸形,变成衰退型3、细胞死亡,出现自溶现象。4、有的微生物在此期合成或释放次生代谢物。5、芽孢杆菌在此期释放芽孢。•衰亡期来临的原因–是外界条件越来越不利于菌体的生长繁殖，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。•酵母的生长情况与细菌类似•菌丝状微生物（放线菌、霉菌）一般经过三个阶段：–生长停滞期、迅速生长期、衰退期–没有明显的对数生长期三、微生物生长规律对工业生产的指导意义•缩短延迟期•把握对数期•延长稳定期•监控衰亡期缩短延迟期•延迟期的存在使发酵周期延长，生产中为降低成本，提高设备利用率，需缩短延迟期。•酵母菌和细菌延迟期较短，一般需几小时，霉菌较慢，需十几小时，而放线菌的延迟期最长。•缩短延滞期的方法1、接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄；2、加大接种量；3、在种子培养基中加入某些发酵培养基的成分。把握对数期在需要获得菌体的发酵生产中（如酵母菌、单细胞蛋白），则需连续流加或补加发酵原料，此时菌体随营养浓度增加而生长速率上升，从而获得大量的菌体。延长稳定期若获得初级代谢产物，如氨基酸、乙醇等，这些产物的形成与微生物细胞的形成过程同步，因此在稳定期为最佳收获期。因此必须连续流加碳源和氮源，移走代谢产物，从而提高产量。若获得次级代谢产物，如抗生素、维生素、色素等发酵来说，这些产物的形成与微生物细胞生长过程不同步，形成产物的高峰多在稳定期的后期或衰亡期。该类型发酵同样需流加营养物质，并把握好收获时间。微生物的分离和纯培养一、无菌技术二、微生物的分离方法三、微生物的培养一、无菌技术•对微生物进行研究与应用时，必须防止被其他微生物污染。•无菌技术：将微生物分离、转接及培养时防止被其他微生物污染的技术。1、对使用的器具及培养基的灭菌2、创造无菌环境二、微生物的分离方法•微生物在自然界中不仅分布很广，而且都是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必须把混杂的微生物类群分离开来，以得到只含一种微生物的培养。•纯培养：微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称纯培养。•纯培养的分离，是研究和利用微生物的第一步，是微生物工作中最重要的环节之一。获得纯培养最常用的分离方法有：稀释分离法平皿划线法单细胞挑取法利用选择培养基法等。平皿划线法•将已灭菌的培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，用接种环沾取少许待分离的菌，在培养基表面进行平行划线、扇形划线、方格划线或连续划线等，微生物将随着划线次数的增加而分散，经保温培养形成菌落。•划线开始的部分细菌分散度小，形成的菌落往往连在一起。由于连续划线，微生物逐渐减少，划到最后，常可形成单个孤立的菌落。•这种单个菌落可能由一个细胞繁殖而来，故可获得纯培养。•用其他工具如L形玻璃代替接种环，在培养基表面涂布，亦可得到同样结果。此法较为简便。稀释分离法•液体稀释法将待分离的微生物接种到液体培养基中培养后,计数,再将其稀释到一定程度,使一定体积液体大约只含一个细胞,则取该菌液接种到盛有液体培养基的试管中,静置,观察,如果管底只出现一个菌落,则可达到分离目的.该方法适用于细胞较大的微生物.•稀释倒平板法这是最常用的纯种分离法.先将待分离的菌体作一系列的稀释(如1：10、1：100、1：1000、1：10，000……)，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃的琼脂培养基相混合，摇匀后倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，平皿上就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。•涂布平板法:对于某些热敏感菌、好氧菌来说,采用该方法。把上述已稀释的样品滴加入平板表面，用无菌玻璃棒将菌液均匀涂抹于整个平板上，经培养后，长出单菌落，获得纯培养。单细胞挑取法这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。具体方法是将显微挑取器装置在显微镜上，把一滴菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管或显微针，在显微镜下对准某一个单独的细胞挑取，再接种到培养基上培养。此法需要非常熟练的操作人员，多限于高度专业化的科学研究中采用。利用选择培养基法•不同微生物需要不同的营养物质。主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件.例如在从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈。微生物纯培养分离方法的比较稀释分离法既可定性，又可定量，用途广泛平板划线法方法简便，多用于分离细菌单细胞挑取法局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法适用于分离某些生理类型较特殊的微生物三、微生物的培养（一）好氧培养与厌氧培养1、好氧培养好氧培养一般以空气作为氧的来源。好氧培养法好氧菌液体培养法好氧菌固体培养法试管斜面、平板茄子瓶摇瓶培养、三角瓶浅层培养台式发酵罐