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微生物限度检查法微生物限度检查法（2005年版一部）附录ⅩⅢC.微生物限度检查法微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌素、酵母菌数及控制菌检查。微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25～28℃，控制菌培养温度为36℃±1℃。检验结果的报告以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告。检验量检验量即一次试验所用的供试品（g、ml或cm2）。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；中药膜剂为50cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验应增加10g或10ml。检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，可采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。1.液体供试品取供试品10ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。2.固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。3.需用特殊供试液制备方法的供试品(1)非水溶性供试品方法1取供试品5g(5ml),加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20的供试液。方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录XIIIB无菌检查法中供试品的无菌检查项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5~10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液。（2）膜剂供试品取供试品100cm2，剪碎，加50ml或100ml的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1：10或1：20的供试液。(3)肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1：10的供试液。（4）气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1：10的供试液。（5）具抑菌活性的供试品当供试品有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下。①培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。②离心沉淀集菌法取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。③薄膜过滤法见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。④中和法凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。细菌、霉菌及酵母计数细菌计数法1平皿菌落计数法取均匀供试液，进一步稀释成1∶102、1∶103等稀释级。分别取连续三级10倍的供试液各1ml，置直径为90mm的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释级应做2~3个平皿。培养基细菌计数为营养琼脂培养基。（在特殊情况下，同时点计霉菌、酵母菌菌落数）阴性对照试验取供试验用的稀释剂1ml，置无菌平皿中，按平皿菌落计数法用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。培养时间48小时。分别在24小时及48小时点计菌落数，一般以48小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。菌数报告规则细菌数宜选取平均菌落数在30~300之间的稀释级，作为报告菌数计算的依据。*如有1个稀释级平均菌落数在30~300之间，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告。*如同时有2个稀释级平均菌落数在30~300之间时，按下式计算两级比值：比值=高稀释级的平均菌落数稀释倍数/低稀释级的平均菌落数稀释倍数当比值≤2时，以两稀释级的均值报告；当比值＞2时，以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告。*如同时有3个稀释级平均菌落数在30~300之间时，以后2个稀释级计算级间比值报告。*如各稀释级的平均菌落数均不在30~300之间，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。*如各稀释级的平均菌落数均在300以上，按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。*如各稀释级的平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。*如当1∶10（或1∶102）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1∶10）稀释级时，应以培养基稀释法测定。2培养基稀释法取供试液（原液或1∶10、1∶102）3份，每份各1ml，分别注入5个平皿内（每皿各0.2ml）。每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。每1ml注入的5个平皿的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得3组数据，以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。*如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则报告菌数为小于10个。一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数较高的培养基中的菌数为计数结果。含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。菌数报告规则宜选取细菌平均菌落数在30～300之间、霉菌宜平均菌落数在30～100之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。稀释液稀释液配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。1.PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液照无菌检查法（附录XIIB）制备。2.PH6.8无菌磷酸盐缓冲液、PH7.6无菌磷酸盐缓冲液按缓冲液（附录XVD）配制后，过滤，分装，灭菌。如需要，可再上述稀释液灭菌前后或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。3.0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装，灭菌。培养基及其制备方法培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。1.营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基及改良马丁琼脂培养基照无菌检查法（附录XIIIB）制备。2.玫瑰红钠琼脂培养基胨5.0g玫瑰红钠0.0133g葡萄糖10.0g琼脂14.0g磷酸二氢钾1.0g水1000ml硫酸镁0.5g除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，加入葡萄糖、玫瑰红钠，分装，灭菌。3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）胨10.0g琼脂14.0g酵母浸出粉5.0g水1000ml葡萄糖20.0g除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，加入葡萄糖，分装，灭菌。4.胆盐乳糖培养基（BL）胨20.0磷酸二氢钾1.3g乳糖5.0g牛胆盐2.0g氯化钠5.0g（或去氧胆酸钠）（0.5g）磷酸氢二钾4.0g水1000ml除乳糖、牛胆盐（或去氧胆酸钠）外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使灭菌后为7.4±0.2，煮沸，澄清，加入乳糖、牛胆盐（或去氧胆酸钠），分装，灭菌。5.胆盐乳糖发酵培养基取未灭菌的胆盐乳糖培养基1000ml，加入0.04%溴甲酚紫指示液25ml，根据要求的用量分装于含倒管的试管中。灭菌。所用倒管的规格应保证产气结果的观察。6.曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）营养琼脂培养基100ml曙红钠指示液2ml20%乳糖溶液5ml亚甲蓝指示液1.3~1.6ml取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液，摇匀，倾注平皿。7.麦康凯琼脂培养基（MacC）胨20.0g1%中性红指示液3ml乳糖10.0g琼脂14.0g牛胆盐5.0g水1000ml氯化钠5.0g除乳糖、1%中性红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。8.4-甲基伞形酮葡萄苷酸（4-methylumbelliferyl-β-D-glu-curonide,MUG）培养基胨10.0g磷酸二氢钾（无水）0.9g硫酸锰0.5mg磷酸氢二钠（无水）6.2g硫酸锌0.5mg亚硫酸钠40mg硫酸镁0.1g去氧胆酸钠1.0g氯化钠5.0gMUG75mg硫酸钙50mg水1000ml除MUG外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使灭菌后为7.3±0.1，加入MUG，溶解，每管分装5ml，灭菌。9.三糖铁琼脂培养基（TSI）胨20.0g硫酸亚铁0.2g牛肉浸出粉5.0g硫代硫酸钠0.2g乳糖10.0g0.2%酚磺酞指示液12.5ml蔗糖10.0g琼脂12.0g葡萄糖1.0g水1000ml氯化钠5.0g除三种糖、0.2%酚磺酞指示液、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使灭菌后7.3±0.1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，制成高底层（2~3cm）短斜面。10.四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）胨5.0g硫代硫酸钠30.0g牛胆盐1.0g水1000ml碳酸钙10.0g取上述成分，混合，微温溶解，灭菌。临用前，取上述培养基，每10ml加入碘试液0.2ml和亮绿试液0.1ml，混匀。11.沙门、志贺菌属琼脂培养基（SS）胨5.0g硫代硫酸钠8.5g牛肉浸出粉5.0g中性红指示液2.5ml乳糖10.0g亮绿试液0.33ml牛胆盐8.5g琼脂16.0g枸橼酸钠8.5g水1000ml枸橼酸铁铵1.0g除乳糖、中性红指示液、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使灭菌后为7.2±0.1，滤过，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀