总RNA的提取及相关实验方法

总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1mlTrizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1mlTRIZOL加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRaTaqTM，TaKaRaEXTaqTM和PyrobestTMDNAPolymerase。TaKaRaTaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRaEXTaqTM是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTMDNAPolymerase也是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液：TaKaRaTaqTM或TaKaRaEXTaqTM的配方ReagentQuantity,for50µlofreactionmixture10XPCRbuffer（Mg2+free）5µlMgCl2（25mM）如TaKaRaTaqTM加3µl如TaKaRaEXTaqTM加4µl2.5mMdNTPmix4µl10µMPrimer上游1µl10µMPrimer下游1µlTemplateDNA1µlTaq或EXTaqDNAPolymerase0.25µlSteriledeionizedwaterUpto50µlTotal50µl/SamplePyrobestTMDNAPolymerase的配方ReagentQuantity,for50µlofreactionmixture10XPyrobestbuffer5µl2.5mMdNTPmix4µl10µMPrimer上游1µl10µMPrimer下游1µlTemplateDNA1µlPyrobestTMDNAPolymerase0.25µlSteriledeionizedwaterUpto50µlTotal50µl/Sample①反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl以节约试剂；②将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；③如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30~50µl的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；2.按以下程序进行PCR扩增。PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。StepTemperature,°CTime,minNumberofcyclesNote起始变性94~951-31变性94~950.5-225-35退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化退火37-700.5-2延伸70-75根据扩增产物的大小每分钟延伸1000bp最终延伸70-75101反应结束后，抽取扩增样品5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNAmarker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。RT-PCRProtocol:TaKaRaOneStepRNAPCRKit(AMV)1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液ReagentQuantity,for50µlofreactionmixture10×OneStepRNAPCRBuffer5µl25mMMgCl210µl10mMdNTPmix5µlRNaseInhibitor(40U/µl)1µlAMV-OptimizedTaq1µlAMVRTaseXL(5U/µl)1µl上游特异Primer(20µM)1µl下游特异Primer(20µM)1µl实验样品RNA（≤1µgTotalRNA）1µlRNaseFreedH2O24µlTotal50µl/Sample1.反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl以节约试剂；2.将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；3.如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30~50µl的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；2．按以下条件进行反应StepTemperature,°CTime,minNumberofcyclesNote逆转录50301逆转录酶失活9421变性940.525-35退火37-650.5退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化延伸72根据扩增产物的大小Taq酶每分钟延伸1000bp最终延伸72101反应结束后，抽取扩增样品5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNAmarker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。琼脂糖核酸电泳1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30ml）；3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4.室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；6.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loadingbuffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可；8.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5%1,000～30,0000.7%800～12,0001.0%500～10,0001.2%400～7,0001.5%200～3,0002.0%50～2,000胶回收纯化DNA1.琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；2.按照每100mg加400µl的量加入bindingbuffer，放入到EP管振荡器中，45℃～55℃温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5分钟）；3.取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm离心1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；4.加500µl的washbuffer至柱中，8,000rpm离心1分钟。弃管中的溶液；5.重复操作4步的操作1次，最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒，除去痕量的washbuffer；6.将纯化柱放入一个新的EP管。加30~40µlH2O或者elutionbuffer至纯化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。7.注：若想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按100µl液量加400µl的bindingbuffer,其余的步骤不变。血清制备1.取血后，37oC下，让血液凝固1到2小时（不加抗凝剂）；2.4oC冰箱过夜（让血块固缩）；3.当血清自然析出后，4oC，3000转/分，离心10分钟，分离血清，弃去不溶物；4.将血清移至一干净试管，并分装成小份，储藏在-80oC。ELISA一、包被抗原1.用50mM的碳酸盐包被缓冲液（pH9.6）溶解抗原，使抗原浓度为10-20μg/ml，加100μl/孔到96孔酶标板，4oC放置过夜。2.第二天弃去包被液后，用PBST洗涤3次，每孔加入150μl1％BSA37oC封闭1小时。3.PBST洗涤3次后，每孔加入100μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37oC孵育2小时。4.PBST洗涤5次后，加入100μl稀释后的HRP标记的二抗，37oC孵育1小时。5.PBST洗涤5次后，显色剂显色20min后，酶标仪上读取A405吸收值。二、包被细胞1.在96孔培养板上接种细胞数为1x104cells/well，37℃过夜培养。2.第二天用PBS洗涤培养板2-3次。3.加入125µl/well10%Formalin（1:10稀释）,室温下固定15min。4.用ddH2O洗涤培养板3次，并晾干，储藏在2-8oC备用。5.用PBST洗涤3次，每孔加入150μl1％BSA37oC封闭1小时。6.PBST洗涤3次后，每孔加入100μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37oC孵育2小时。7.PBST洗涤5次后，加入100μl稀释后的HRP标记的二抗,37oC孵育1小时。8.PBST洗涤5次后，显色剂显色20min后，酶标仪上读取A405吸收值。50mM的碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/LpH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,Na2CO30.15克,NaHCO30.293克,蒸馏水稀释至100ml。ABTS作为底物进行显色反应(10ml)：0.2MNa2HPO42.4ml0.1M柠檬酸2.6mlddH2O5mlABTS5mgH2O2(30%)4ul（用前加入）注意：一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。不同的显色系统对应不同的光吸收值。组织病理技术组织处理：1.取新鲜组织厚度不超过5mm，10%中性福尔马林固定，大于24小时。2.固定后冲水12-24小时，3.75%酒精，1次，1小时，4.85%酒精，1次，1小时，5.95%酒精，3次，1小时，6.100%酒精，3次，1小时，7.二甲苯，2次，1小时，8.石蜡浸泡，3次，2小时，HE染色：{水化}1.二甲苯，2次，5-10分钟，2.100%酒精，1次，1-2分钟，3.95%酒精，1次，1-2分钟，4.85%酒精，1次，1-2分钟，5.75%酒精，1次，1-2分钟，6.过蒸馏水，{染色}1.Mayer氏苏木素，1分钟，2.温水冲洗，5-10分钟，3.75%盐酸酒精，1-2分钟，4.自来水冲洗，30秒钟，5.依红复染，1-2分钟，6.自来水洗，30秒钟，7.85%酒精，1次，1-2分钟，8.95%酒精，2次，1-2分钟，9.100%酒精，2次，1-2分钟，10.二甲苯，2次，5-10分钟，11.中性树胶封片。免疫组化染色一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃1小时）。（1）二甲苯、II,各10分钟。（2）梯度酒精：100%，2分钟95%，2分钟80%，2分钟70%2分钟。（3）蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温10分钟（避光）。3．蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。4．抗原修复：根据待检测的抗