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脂质体在超声药物和基因传递中的应用摘要作为药物和基因传递系统的脂质体在大多数药物治疗中起到重要的作用。近来，在超声控制药物释放和超声增强药物传递系统中，脂质体用来包裹气体和药物。通过不同的方法制备可发生回声脂质体，包括冻干，高压，生物素-抗生物素蛋白结合。目前，超声控制释放药物和用于基因传递的脂质体体外主要应用于心脏病，中风和癌症的治疗。这些传递系统应用于临床还需要全面的了解，提高物理性质以避免体内快的清除，还有可能的副作用，包括使用的超声。本文献的目的是在超声增强脂质体和基因传递的研究领域为研究者提供研究方向。关键字：脂质体；超声；药物传递；基因传递；气体；氧化亚氮1.引言药物到达病变部位的有效的传递很大程度上取决于药物足够的局部浓度和足量药物跨过内皮细胞的转运。脂质体药物传递系统已被证实有增加体内特殊病变部位药物剂量的作用[1-4].基于超声的方法是通过增加药物跨细胞膜或内皮屏障的作用来提高药物或者基因的传递[5-9].应用适当的参数,超声能形成空腔,它是一个气体空泡成核,生长,震动的过程.空腔形成包括快速生长和气泡的破裂(惰性空腔)或者气泡持久的震荡(稳定的空腔).两种形式的空泡可以对组织产生较强的物理-化学或生物效应[5].尤其是,空腔气泡的破裂导致冲击波或者高速的微喷射流,它们可以击穿细胞和组织的细胞膜,从而来提高药物的转运.由于体内缺少内源性气体，血液和组织组成的环境很难诱导惰性空腔，除非处于超声剧烈震荡和与之相关的负压的条件下[10].然而,剧烈震荡可能会破坏细胞和组织,因此需要引起注意。先前已有的空化核，一种超声造影剂，能降低形成空腔的阈值。在超声造影剂存在的条件下，较低能量的超声就可以使药物或者基因方便的到达许多种细胞，如鼠的成纤维细胞，软骨细胞[11],中国仓鼠卵巢细胞[12],人癌细胞HeLa,NIH/3T3C127I[13,14],前列腺癌细胞DU145[7],还有许多组织比如肌肉[15-18],肝脏[19,20],肺[19],脉管系统[19,21-23],大脑,和肿瘤部位[8,24-26].超声造影剂一般由微气泡组成,这种微气泡由表面活性剂来稳定[27,28].经常使用的表面活性剂包括血清白蛋白,聚合物,磷脂[29].当用磷脂作为气体稳定剂,两种结构中的一种是典型要的:在气泡的表面有脂质单层,或者包含气体的脂质体(回声脂质体)[30-32].当用于增强超声易化药物和基因传递时,回声脂质体具有以下特点:1)回声脂质体与普通脂质体有着相似的载药量.2)包裹着治疗制剂的回声脂质体可与抗体结合,靶向到特殊的病变部位,形成局部高浓度并降低系统毒性.3)可以控制内容物的释放速率。使用单个的高振幅的超声脉冲可以达到快速释放，用一系列的低振幅的脉冲可以达到缓释释放，或者两者结合使用。这些选择有些情况下特别使用，比如有时要提高局部浓度达到治疗水平并且使其保持一段时间。4)超声激发气泡破裂引起的空腔可以增加不同粒径的分子对细胞和组织的渗透性，因此可以促进药物或基因向细胞和组织转运。5)回声脂质体的超声反射可以引导药物和基因的传递。2.回声脂质体概述脂质体是一种自发形成的脂质双分子层，内部是从大量水相中分离出来的亲水的小室（图1）[33].与脂质单分子层结构相比，脂质体的特点就是可以延伸，两面性和分开的亲水和疏水区域。脂质双分子层的亲水基朝向水相（内部和外部），两个脂质层的疏水基相互靠近，形成了膜的内核。脂质体作为药物传递系统的特别之处就是它能同时包裹水溶性和水不溶性物质。水溶性物质被包裹在水相内核，水不溶性或油溶性疏水药物包在脂质双分子层中[34]。由于脂质体可以是阳性的（在处方中加入阳离子脂质），它们可以载大量的不需要特别生产或处理过程的DNA，并且有较低的免疫反应在基因传递中[35,36]。由于高稳定性，提高生物分布和在血液中的最优循环性，有些脂质体处方已被FDA认证[4]（表1）。脂质制剂最初被修饰形成气体包囊作为靶向造影剂用于超声成像增强剂[38-42].这些制剂被命名为回声脂质体（见图2和表2）.据推测，当气体被包裹在脂质体内，由于热力学原因，表现出像疏水药物一样位于脂质双分子层的两个单分子之间或者作为单分子包裹的气泡在脂质体的水相隔室中[43].回声脂质体保留了普通脂质体的特性因此可以共同包裹气体和药物或者基因作为药物和基因的传递体[44-46]。最新证据表明气体微囊的稳定性很大程度上取决于包裹的气体和脂质壳的性质[47]比如气体跨过脂质壳的扩散速度[48,49]，脂质层的厚度和微泡的粒径[50,51],和人血清和血清蛋白的存在[52].图1.脂质体的脂质双分子层示意图。根据制备方法，三种基本的回声脂质体结构已被研究（图2和表2）.第一种回声脂质体有两个室，正如前面提到的。小室中含有气体并用单层与大室分开，大室中含有水相（图2A）。这一结构可通过低压冻干法制备[32,38]或者高压冷冻法。第二种结构也称为囊泡脂质体，有单分子层包裹的气体囊泡在脂质体的水相中[53](图2B)。囊泡脂质体是基于通过相转变蒸发的方法制备的PEG修饰的脂质体（PEG-脂质体）；PEG-脂质体放在充有高压全氟丙烷气体的管形瓶中，然后用超声仪进行超声[46].第三种结构是普通脂质体通过生物素-抗生物素蛋白键共价接合到稳定的气体囊泡上，形成一种复合物[45](图2C).低压冻干法制备回声脂质体包括脂质体在甘露醇存在条件下的冷冻干燥[32]，使其产生两个室。小室包含气体并用脂质体的单层与大室分开，大室含有水相。用这种方法制备时，在冷冻和升华干燥步骤中包含一些没有冷冻保护作用或者容易结晶的溶质（如甘露醇）是很重要的。甘露醇的重要功能是引起双分子层破裂并使破裂的脂质体最大程度的暴露于空气中[47].Huang等人介绍的高压冷冻技术产生相同结构的回声脂质体。在这一方法中，通过增加气体的压力产生一个过饱和水相，然后进行冷冻操作，这样导致气体和溶质分子浓缩，对包囊是有利的[43].由于气体低的溶解度，传统的制备脂质体的过程都无法包裹气体。通过加压来增加气体的包裹可以用Henry方程解释。因为大多数气体的溶解度很低，脂质体包裹气体需要增加气体在水溶液中的数量。根据Henry方程，气体的溶解度与液体上方气体的压力成正相关。当气体的压力比周围温度对应的平衡饱和气压值低，相当，或者高时，溶液被称为不饱和，饱和或者过饱和。因此，随着压力增加，溶液中气体分子的浓度也增加。随后的冻干步骤可能有两个目的，增加溶解气体的局部浓度和大量气体中小块核的形成。这一步骤不仅将空气包裹而且也将溶解于水相中的药物一起包裹[54]。最近，一种新的生产有声学活性的脂质体已被研究，通过生物素-抗生物素蛋白键使脂质体和气体囊泡连接。每个微泡周围可连接平均直径200nm和100nm的脂质体分别高达1000和10000个（图2C）。药物和基因可用传统的方法装载于脂质体中。连接脂质体和微泡的键，含有5%的聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-生物素（PEG-DSPE-生物素），很大程度上取决于抗生物素蛋白的浓度（高于抗生物素蛋白浓度10nM）。脂质体-忍耐性强的微泡随着声波振动并且逐渐瓦解，方式与微泡造影剂相同。最近FDA批准的磷脂基质的造影剂的典型结构是由一层脂质单分子膜包围高分子量（400Da）的气体[55,56]。这一造影剂已被用于药物载体，特别是包裹疏水性药物，尽管疏水性药物和基因可以在微细胞表面吸附。气态核产生声学阻道失配，这将导致微泡有高回音，可以被用于超声波成像。包裹或吸附的药物或基因可以通过超声释放[15,21,27,57,58]。尽管它们代表着可行的发展方向，需要理解的是回声脂质体制剂还仍处于临床前阶段。图2.三种不同类型的回声脂质体示意图。A).表示一种回声脂质体的结构，水相内容物通过超声释放。在制备过程中希望有大量的不均一性存在，以致于气体和水相室的比例有很大不同。然而，所有脂质体是单层是不可能的。B).含有C3F8气体的PEG修饰的回声脂质体结构。C).表面载有脂质体的微泡。微泡由5%DSPE-PEG2k包衣，并通过5%DSPE-PEG2k-生物素与载有5%DSPE-PEG2k-生物素和5%NBD-胆固醇通过抗生物素蛋白共价连接。NBD-胆固醇提供了混合载体结果的最优荧光测定，使结合量化，并使细胞内陷由于细胞-载体相互作用。3.药物装载和超声刺激释放脂质体可以装载大量制剂，包括亲水性和亲脂性药物，寡核苷酸，蛋白质，多肽和基因等[3,35,59-63].回声脂质体保留了普通脂质体载药的性质。例如，产生回声活性的脂质体的过程与含有15%分子量黄绿素包裹效率是相一致的，黄绿素是一种存在于含有水溶性药物的水相室的荧光指示剂。当装载水溶性药物的脂质体含有气体，就变成了对超声刺激敏感的药物。有两个室的回声脂质体超声刺激时释放药物最可能的机制从脂质体的结构可以看出来，其结构中一个脂质体中含有两个室。声波较弱的相会引起空气的膨胀并伸展到双分子层。如果压力足够使其延伸到脂质体膜，并超过弹性限度，脂质体内容物就会被释放出。回声脂质体对超声刺激的敏感性与脂质体的组成和包裹的气体以及超声应用参数有关。脂质双分子层通过疏水基相互作用而紧密连在一起，这些疏水基有自封性质导致脂质体表面破裂后又会很快封闭起来[43,64]。显然，像白蛋白包衣的阿马诺嗪那样的硬壳造影剂只对超声波压力有反应，当压力足够大时就可以引起壳不稳定。这是因为白蛋白的柔韧性没有磷脂壳好。不像白蛋白基质的囊泡破裂依赖于足够强烈的超声，脂质包裹的囊泡扩张和收缩平滑，并且即使在超声过程中也可以立即自发组装修复膜结构[65,66]。因此，应用超声时，磷脂壳的囊泡在它们变得不稳定或合并前可以延伸比它们最初的表面积多10倍[65]。因此，通过改变脂质膜的刚性来影响其对超声的反映性是可行的。最优的气体是在脂质体中有大的体积并在血液中的扩散速率低[48,49]。最有效的超声波是组织可以忍受的最强的声强度的一小段波[43]。这些参数对选择合适的超声刺激是重要的，同时每次应用时都需要研究。疏水性药物可以装载到回声脂质体中；但是理论上，超声时它们可能更加耐受从脂质体中释放，因为它们与脂质体的联系是基于在双分子层内部的溶解度比在水中的高。因此，药物可能仍留在破裂脂质体的脂质碎片中。一种处理疏水性药物的方法是使用环糊精赋予它们亲水性。环糊精的外部表面是亲水的，并有一小块疏水基结合区，因此可以显著增加疏水性药物的水溶性[54]。通过亲水基团包衣的疏水性药物就有和亲水性药物相同的释放特性。4.回声脂质体增强的超声空腔细胞膜和内皮是许多药物特别是基因药物的屏障。细胞膜由一脂质双分子层膜（厚度50nm），其中嵌有蛋白质分子或者在其表面[67,68]。内皮由单分子内皮细胞组成，内皮细胞之间有紧密连接可以封闭管腔。超声被用来增加细胞和内皮的通透性，使药物和基因能到达细胞和组织。回声脂质体装载的药物不仅能靶向病变组织，增加该部位的局部浓度，而且可以靶向增强超声易化细胞和内皮的通透性。除了释放脂质体内容物和提供该过程的成像外，超声可以对组织产生效应，协同药物传递，即通过空腔效应。超声空腔效应可通过回声脂质体增强。当气泡破裂时，速度梯度和周围液体产生的压力产生高的机械强度[69]。这些能量足够使细胞膜产生暂时的开口，这一现象的强度可能受超声参数，细胞类型和造影剂性质的影响[70]。回声脂质体的超声行为不同于阿马诺嗪，一种常用的蛋白造影增强剂。当使用输出水平高于阿马诺嗪的碎片阈值（3.5MHz，MI=0.27），4.5MHz谐波和6.9MHz基本的B型超声波时，对于两种类型的B型超声波，回声脂质体耐受时间长于60s然后破碎，而用同样的波时阿马诺嗪在5s内被破坏[71]。Akowuah等比较了SonoVue，BR14™和阿马诺嗪关于超声增强的裸pGL3萤光素酶质粒向猪的血管平滑肌细胞转运的体外实验。所有这些造影剂都含有全氟化碳气体，但是阿马诺嗪是清蛋白基质的制剂，但是SonoVue和BR14™是磷脂稳定的囊泡[72].这两种脂质稳定的囊泡中，SonoVue的基因