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第十三单元重组DNA技术本单元考点1.重组DNA技术的概述（1）重组DNA技术相关的概念（2）基因工程的基本原理2.基因工程与医学（1）疾病相关基因的发现（2）生物制药（3）基因诊断（4）基因治疗（5）遗传病的防治重组DNA是指不同来源的DNA分子通过末端共价连接形成重新组合的DNA的过程。第一节概述一、相关的概念（一）DNA克隆来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合称克隆。获取同一拷贝的过程称为克隆化，即无性繁殖。应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA连接，合成具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程，也称基因克隆或重组DNA。实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。（二）限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶可以把DNA切成长度不同的片段，是重组DNA中重要的工具酶。如BamHⅠ（三）目的基因应用DNA重组技术的目的：分离、获取某一感兴趣的基因或DNA序列；获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因。即纯化的特定基因（靶基因）。（四）基因载体游离的外源DNA是不能复制的，需将外源基因连接到有自我复制及表达能力的DNA分子上。基因载体：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达的有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。在重组DNA中常用的载体包括质粒DNA、噬菌体DNA、柯斯质粒载体（粘粒）、病毒DNA和人工染色体等类型。载体分为克隆载体和表达载体为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。二、基因工程基本原理（一）目的基因的获取目的基因主要有以下几种来源：1.cDNA文库以mRNA做模板通过反转录的方式获得的DNA。2.基因组DNA文库用限制性内切酶切割组织或细胞染色体，得到所需DNA基因片断。3.聚合酶链式反应（PCR）用体外快速扩增方法得到所需目的基因。4.化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列用DNA合成仪合成。（二）克隆载体的选择克隆载体的选择的标准：①能自主复制；②具有两个以上的遗传标记物便于重组体的筛选和鉴定；③有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；④分子量小，以容纳较大的外源DNA。（三）外源基因与载体的连接目的基因与载体DNA片段连接成一个完整的重组体分子。连接方式有以下几种：1.粘性末端连接。2.平端连接。限制性内切酶切割产生的平端、粘端补齐或切平形成的平端。3.同聚物加尾连接。在末端转移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。4.人工接头连接。由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。（四）重组体DNA导入受体菌1.受体菌条件（1）安全宿主菌。（2）限制酶和重组酶缺陷。（3）处于感受态。（在0-4℃下用氯化钙处理增加细胞膜的通透性成为感受态细胞）。2.导入方式：转化、转染和感染。通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细菌或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用。真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程称为转染。即将表达载体导入真核细胞的过程。（五）重组体的筛选外源重组DNA导入宿主细胞后，首要任务是要筛选含有目的基因的转化菌并加以扩增。1.直接选择法（1）抗药性标记选择是筛选重组体最常用的方法。R如重组体携带某种抗药性标志基因，只有含这种抗药基因转化的细菌才能在含有该抗生素的培养板上生存并形成菌落，据此可筛选出转化菌。（2）标志补救转化或转染的外源基因表达产物可弥补基因缺陷性宿主菌的性状，可以利用营养突变菌株进行筛选。（3）分子杂交法用与外源DNA互补的放射性核素标记探针与重组子DNA进行杂交筛选。①原位杂交：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。使用DNA或RNA探针检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。②Southern印迹：将待测核酸样品结合在硝酸纤维素膜上，再与溶液中的探针杂交。含有目的基因的重组DNA与探针结合而被放射性核素标记。2.免疫学方法筛选：利用特异抗体与目的基因的表达产物（作为抗原）之间相互作用进行筛选，不是直接鉴定靶基因。可分为免疫化学方法及酶免检测分析等。免疫学方法特异性强、灵敏度高，尤其适宜于筛选无任何选择标志的基因。重组DNA技术操作过程可形象归纳为：分—分离目的基因切—限制酶切目的基因与载体接—拼接重组体转—转入受体菌筛—筛选重组体六、克隆基因的表达克隆的目的基因在受体细胞表达出具有生物活性蛋白质。该过程需要正确的基因转录、有效地蛋白质翻译和适当的转录、翻译后加工的过程。这些过程在不同的表达体系中是不一样的。基因工程根据宿主细胞性质的不同，分为原核表达体系和真核表达体系两大类。第二节基因工程与医学一、疾病基因的发现重组DNA技术的应用使分子遗传学家有可能根据基因定位，而不是它的功能来克隆一个基因。根据克隆基因的定位和性质所提供的线索，可进一步确定克隆的基因在分子遗传病中的作用。因此，一个疾病相关基因的发现不仅可导致新的遗传病的发现，而且对遗传病的诊断和治疗都是极有价值的。二、发展新药物利用基因工程技术生产有应用价值的药物。如重组疫苗，如乙肝疫苗等。基因工程肽类药物：各种干扰素、细胞介素、生长激素、表皮生长因子、胰岛素等。基因工程抗体。三、DNA诊断（基因诊断）人类大多数疾病的发生都与基因有关。基因变异是疾病发生的重要原因。基因变异包括内源基因的变异（基因结构突变、基因表达异常）和外源基因的入侵。利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病做出诊断的方法。基因诊断的特点是：针对性强、灵敏度高、适用范围广、可以做到早期诊断。四、基因治疗早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。基因治疗的基本方法有：1.基因矫正；将致病基因的突变碱基序列纠正，正常部分保留。2.基因置换；用正常的基因导入到功能有缺陷的细胞内，矫正或置换致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。3.基因增补；将正常基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物能补偿缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。4.基因失活。利用反义技术针对性的封闭某些基因使之有害的表达受到抑制。五、遗传病的防治1.产前诊断。2.携带者测试。3.症候前诊断。4.遗传病易患性。【习题】1.关于基因工程的叙述错误的是A.也称基因克隆B.只有质粒DNA能被用作载体C.需要供体DNAD.重组DNA转化或转染宿主细胞E.重组DNA需进一步纯化、传代和扩增『正确答案』B2.有关理想质粒载体的特点正确的是A.为线性单链DNAB.含有多种限制酶的单一位点C.含有同一限制酶的多个位点D.其复制受宿主菌控制E.不含耐药基因『正确答案』C3.重组DNA的连接方式不包括A.粘性末端连接B.平头末端连接C.粘性末端与平头末端连接D.DNA连接子技术E.DNA适配子技术『正确答案』C4.基因治疗的基本方法不包括A.基因突变B.基因校正C.基因置换D.基因增补E.基因失活『正确答案』A