左卡尼汀对D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化作用的研究

左卡尼汀对D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化作用的研究摘要：为了研究左卡尼汀（ｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅ，ｌｃ）对ｄ－半乳糖所致衰老小鼠的抗氧化作用，试验将５０只小鼠随机分成５组，即空白对照组、模型组和左卡尼汀治疗组［０．２５、０．５０、１．００ｇ/（ｋｇ·ｄ）］，采用ｄ－半乳糖复制亚急性衰老小鼠模型，试验６周后处死小鼠，测定其血浆、脑组织及肝脏中的超氧化物歧化酶（ｓｏｄ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ｇｓｈ－ｐｘ）活性及丙二醛（ｍｄａ）含量。试验结果显示，左卡尼汀能显著提高衰老小鼠血清、脑组织及肝脏中的ｓｏｄ、ｇｓｈ－ｐｘ活性，降低ｍｄａ含量，且呈剂量依赖性。表明左卡尼汀有一定的抗衰老作用，其机制可能与抗氧化作用有关。关键词：左卡尼汀（ｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅ，ｌｃ）；抗衰老；ｄ－半乳糖ｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｆｆｅｃｔｏｆｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅｏｎｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅｉｎｄｕｃｅｄａｇｉｎｇｍｉｃｅｌｕａｎｈａｉ－ｙｕｎ（instituteofmaterialmedical，collegeofpharmacy，ｂｉｎｚｈｏｕｍｅｄｉｃａｌｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｙａｎｔａｉ２６４００３，ｓｈａｎｄｏｎｇ，ｃｈｉｎａ）ａｂｓｔｒａｃｔ：５０ｍｉｃｅｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙａｌｌｏｃａｔｅｄｔｏ５ｇｒｏｕｐｓｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅｏｎｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅｉｎｄｕｃｅｄａｇｉｎｇｍｉｃｅ．ａｐａｒｔｆｒｏｍａｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｌｃｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅａｔｔｈｒｅｅｌｅｖｅｌｓｕｃｈａｓ０．２５，０．５０ａｎｄ１．００ｇ／ｋｇ·ｄ．ｕｓｉｎｇｔｈｅｓｕｂａｃｕｔｅｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅｉｎｄｕｃｅｄａｇｉｎｇｍｏｄｅｌ，ｔｈｅｍｉｃｅｗｅｒｅｋｉｌｌｅｄａｆｔｅｒ６ｗｅｅｋｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｓｏｄ，ｇｓｈ－ｐｘａｎｄｍｄａｉｎｔｈｅｂｌｏｏｄ，ｂｒａｉｎａｎｄｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅ．ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｏｄａｎｄｇｓｈ－ｐｘｉｎｂｌｏｏｄ，ｂｒａｉｎａｎｄｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｍｄａｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ．ｉｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅｈａｄａｎｔｉ－ａｇｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｉｎｍｉｃｅ，ａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｍｉｇｈｔｂｅｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｉｔｓａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅ；aｎｔｉ－ａｇｉｎｇ；ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ左卡尼汀（ｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅ，ｌｃ）是一种广泛存在于机体组织中的氨基酸，是一种内源性营养素，其主要功能是参与哺乳动物体内的能量代谢，促进脂肪酸β－氧化［１－３］，同时具有抗氧化、清除自由基等作用［４，５］。本研究以ｄ－半乳糖（ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）建立衰老小鼠模型，给予不同剂量的ｌｃ，检测衰老小鼠血浆、脑组织及肝脏中超氧化物歧化酶（ｓｏｄ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ｇｓｈ－ｐx）的活性及丙二醛（ｍｄａ）的含量，以进一步探讨ｌｃ抗衰老作用机制。１材料和方法１．１仪器ｌｔ－２２４ｓ电子天平（北京赛多利斯公司），ｇｌ－８８ｂ型旋涡混匀器（太仓市科教仪器厂），ｄｋ－９８－１电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司），离心机ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８０４（德国，ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司），ｍｏｄｅｌ６８０酶标仪（美国ｂｉｏ－ｒａｄ公司）。１．２主要试剂左卡尼汀原料药（东北制药总厂提供）；ｄ－ｇａｌ（ｓｉｇｍａ公司生产），ｓｏｄ试剂盒、ｇｓｈ－ｐｘ试剂盒、ｍｄａ试剂盒和考马斯亮蓝蛋白定量测定试剂盒（批号分别为：２０１００５２０、２０１００６０２、２０１００５２６、２０１００６０６），均由南京建成生物工程研究所提供。１．３试验动物spf昆明种小鼠５０只，雌雄各半，体重（１８±４）ｇ，均由山东鲁抗医药股份有限公司动物中心提供，试验动物生产许可证号：ｓｃｘｋ（鲁）２００５－００１７。试验前禁食１２ｈ，自由饮水。１．４方法１．４．１分组与给药昆明种小鼠５０只，随机分成５组，即空白对照组、ｄ－ｇａｌ模型组（以下简称模型组）、ｌｃ治疗组（低、中、高剂量组），每组１０只。除对照组外，其他小鼠每日颈背部皮下注射ｄ－ｇａｌ２００ｍｇ／ｋｇ，每天１次，连续注射６周，空白对照组颈背部皮下注射等体积生理盐水。从第五周开始，ｌｃ治疗组在继续注射ｄ－ｇａｌ的同时，分别注射３个不同剂量的ｌｃ［０．２５、０．５０、１．００ｇ／（ｋｇ·d）］，空白对照组与模型组则注射等量的生理盐水。１．４．２组织处理末次给药后２４ｈ，眼球取血，随后颈部脱臼处死，在冰袋上快速取小鼠脑组织和肝脏，并用冰冷生理盐水清洗后滤纸吸干，精密称量后制成１０％的组织匀浆，在４℃下，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液分装于１．５ｍｌ离心管中，冷冻保存于－２０℃冰箱中。所有指标测定严格按照试剂盒说明进行。１．５统计学处理试验结果采用ｓｐｓｓ１３．０统计软件对数据进行分析，结果以平均数±标准差（ｘ±ｓ）来表示。２结果２．１ｌｃ对衰老小鼠血浆、脑组织和肝脏中ｓｏｄ、ｇｓｈ－ｐｘ活性的影响由表１、表２、表３可见，模型组小鼠血浆、脑组织和肝脏中的ｓｏｄ、ｇｓｈ－ｐｘ活性均明显低于空白对照组，组间比较差异显著（ｐ＜０．０１或ｐ＜０．０５）。ｌｃ治疗组［０．２５、０．５０、１．００ｇ/（ｋｇ·ｄ）］均可明显增加衰老小鼠血浆、脑组织和肝脏中ｓｏｄ、ｇｓｈ－ｐｘ活性，与模型组相比大部分达到显著水平（ｐ＜０．０５或ｐ＜０．０１）。２．２ｌｃ对衰老小鼠血浆、脑组织和肝脏中ｍｄａ含量的影响由表１、表２、表３可见，ｌｃ治疗组［０．２５、０．５０、１．００ｇ/（ｋｇ·ｄ）］和空白对照组小鼠血浆、脑组织和肝脏中ｍｄａ含量相对于模型组明显降低，并随着ｌｃ剂量的增大ｍｄａ含量降低得更加明显（ｐ＜０．０５或ｐ＜０．０１）。３讨论机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，过多的氧自由基可与细胞膜中的类脂质发生过氧化作用，导致细胞膜破坏，引起细胞死亡；同时脂质过氧化物的分解产物（ｍｄａ）还可与ｄｎａ、ｒｎａ、蛋白质和磷脂等物质结合，损伤细胞膜，引起细胞功能紊乱，使整个机体出现衰老特征［６，７］。机体为了防御新陈代谢自由基的损伤和破坏，在组织和细胞中建立并形成了机体的抗氧化系统，主要包括一些抗氧化酶（如ｓｏｄ，ｇｓｈ－ｐｘ等），这些酶往往共同起作用，清除体内的脂质过氧化物，使机体免受自由基的损害，共同维持体内自由基的生成与清除的平衡［８，９］。而ｍｄａ是体内重要的脂质过氧化产物，其含量的多少可反映机体细胞受自由基攻击的严重程度，间接反映细胞损伤的程度［１０］。本研究从衰老小鼠模型上观察到ｌｃ具有一定的清除自由基的作用。试验结果表明，ｄ－半乳糖衰老小鼠中存在着抗氧化和脂质过氧化异常，ｌｃ能够提高血浆、脑组织以及肝组织中ｓｏｄ及ｇｓｈ－ｐｘ活性，降低ｍｄａ含量，且呈剂量依赖性。提示了ｌｃ能通过增强机体清除氧自由基的能力和抗氧化功能，减轻自由基的损伤效应，进而保护细胞免受氧化损伤。本研究从自由基学说方面揭示了ｌｃ通过提高脑组织中内源性的抗氧化系统来提高自身的抗氧化能力，抑制脑内ｍｄａ生成，降低脂质过氧化损伤程度，从而维持细胞内环境的稳定，保护脑组织，减轻自由基对脑组织局部的损伤，起到保护细胞，延缓衰老的作用。至于ｌｃ如何通过血脑屏障、在脑内的分布情况以及对脑神经元的保护作用等还有待进一步研究。参考文献：［１］ｓｔｒｉｊｂｉｓｋ，ｖａｚｆｍ，ｄｉｓｔｅｌｂ．ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｃａｒｎｉｔｉｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙ［ｊ］．ｉｕｂｍｂｌｉｆｅ，２０１０，６２（５）：３５７－３６２．［２］ａｍｅｓｂｎ．ｏｐｔｉｍａｌｍｉｃｒｏｎｕｔｒｉｅｎｔｓｄｅｌａｙｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｅｃａｙａｎｄａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｉｓｅａｓｅｓ［ｊ］．ｍｅｃｈａｇｅｉｎｇｄｅｖ，２０１０，１３１（７－８）：４７３－４７９．［３］ｐｅｓｃｏｓｏｌｉｄｏｎ，ｉｍｐｅｒａｔｒｉｃｅｂ，ｋａｒａｖｉｔｉｓｐ．ｔｈｅａｇｉｎｇｅｙｅａｎｄｔｈｅｒｏｌｅｏｆｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅａｎｄｉｔｓｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ［ｊ］．ｄｒｕｇｓｉｎｒｄ，２００８，９（ｓｕｐｐｌ１）：３－１４．［４］ｂｅｎｖｅｎｇａｓ．ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅｏｎｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｏｎｐｈｙｓｉｃａｌｅｘｅｒｃｉｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ［ｊ］．ｈｏｒｍｍｅｔａｂｒｅｓ，２００５，３７（９）：５６６－５７１．［５］ｒｉｚｏｓｉ．ｔｈｒｅｅ－ｙｅａｒｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅｃａｕｓｅｄｂｙｄｉｌａｔｅｄｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙａｎｄｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ［ｊ］．ａｍｈｅａｒｔｊ，２０００，１３９（２ｐｔ３）：ｓ１２０－１２３．［６］ｌｕｋａｗｓｋｉｋ，ｎｉｅｒａｄｋｏｂ，ｓｉｅｋｌｕｃｋａ－ｄｚｉｕｂａｍ．ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｄｍｉｕｍｏｎｍｅｍｏｒｙｐｒｏｃｅｓｓｅｓｉｎｍｉｃｅｅｘｐｏｓｅｄｔｏｔｒａｎｓｉｅｎｔｃｅｒｅｂｒａｌｏｌｉｇｅｍｉａ［ｊ］．ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｔｅｒａｔｏｌ，２００５，２７（４）：５７５－５８４．［７］凌关庭．抗氧化食品与健康［ｍ］．北京：化学工业出版社，２００４．５４－５８．［８］陈瑾，李荣亨．衰老的自由基机制［ｊ］．中国老年学杂志，２００４，２４（７）：３４．［９］齐冰，丁涛，常正尧，等．泰山黄精对ｄ－半乳糖所致衰老小鼠的抗衰老作用研究［ｊ］．时针国医国药杂志，２０１０，２１（７）：１８１１－１８１２．［１０］兰鸿，杜士明．菟丝子提取物对自然衰老小鼠的抗衰老作用研究［ｊ］．中国药房杂志，２０１０，２１（３９）：３６６７－３６６９．